霉菌檢測(cè)中封閉式培養(yǎng)方法的建立和應(yīng)用

韓 濤，楊雪妮，張 芳

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108）

霉菌是絲狀真菌的統(tǒng)稱(chēng)，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染。食品中污染的霉菌不僅能破壞其基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，造成食物的營(yíng)養(yǎng)損耗以及每年達(dá)數(shù)十億元的經(jīng)濟(jì)損失[4]；而且通過(guò)代謝會(huì)產(chǎn)生有害毒素[5-11]，從而造成健康危害[12-18]，因此，是否污染霉菌是評(píng)判食品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。近年來(lái)，世界各國(guó)紛紛制訂食品中霉菌的各種限量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)加強(qiáng)霉菌檢測(cè)技術(shù)的研究。

我國(guó)先后5 次修訂了食品中霉菌計(jì)數(shù)的方法標(biāo)準(zhǔn)[19-23]，據(jù)此我國(guó)各級(jí)監(jiān)督檢測(cè)機(jī)構(gòu)全面開(kāi)展食品中霉菌的檢測(cè)工作，但是檢測(cè)中霉菌培養(yǎng)物被污染的現(xiàn)象頻發(fā)，這主要是因?yàn)槊總€(gè)疏松干燥絨毛狀的霉菌菌落可產(chǎn)生數(shù)量巨大的孢子，同時(shí)霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長(zhǎng)和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，任何一個(gè)孢子在適宜條件下都能發(fā)展成新的個(gè)體。常規(guī)霉菌檢測(cè)的培養(yǎng)過(guò)程中、以及觀察霉菌菌落時(shí)培養(yǎng)皿的移動(dòng)過(guò)程中，不可避免地造成空氣流動(dòng)，霉菌孢子可趁機(jī)飄散進(jìn)入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴(yán)重的交叉污染和外部侵染，對(duì)霉菌檢測(cè)的質(zhì)量控制形成嚴(yán)峻的考驗(yàn)。而目前這一常見(jiàn)且棘手的問(wèn)題始終困擾著相關(guān)人員，且無(wú)有效的控制措施。

生物體的封閉式培養(yǎng)是指將目標(biāo)培養(yǎng)物利用特定的設(shè)施隔離于相對(duì)獨(dú)立的微環(huán)境中，以進(jìn)行培養(yǎng)的一種技術(shù)，因其具有良好的溫度和濕度控制、污染防護(hù)等優(yōu)點(diǎn)，而在植物的無(wú)土槽培、單細(xì)胞藻類(lèi)的快速培養(yǎng)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[24-25]。如果將封閉式培養(yǎng)方法應(yīng)用于霉菌的檢測(cè)，特定的隔離設(shè)施可以將目標(biāo)培養(yǎng)物隔離以形成霉菌生長(zhǎng)的相對(duì)獨(dú)立的微環(huán)境，進(jìn)而有效杜絕霉菌孢子的擴(kuò)散污染，但是封閉式培養(yǎng)的微環(huán)境中氧氣含量是不可忽視的問(wèn)題，因?yàn)榕囵B(yǎng)過(guò)程中充足的氧氣供給是霉菌正常生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，在通風(fēng)良好的培養(yǎng)環(huán)境中，空氣中的氧氣（體積分?jǐn)?shù)21%）可滿(mǎn)足霉菌的需求，但是如果培養(yǎng)環(huán)境氧氣體積分?jǐn)?shù)太低，霉菌將停止生長(zhǎng)。目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)將封閉式培養(yǎng)方法應(yīng)用于霉菌檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)微氧脅迫下黑曲霉的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)研究，構(gòu)建霉菌的封閉式培養(yǎng)方法以防止霉菌孢子的擴(kuò)散和污染，進(jìn)一步依托食品中霉菌的檢測(cè)分析，比對(duì)封閉式培養(yǎng)方法與常規(guī)敞開(kāi)式培養(yǎng)方法的計(jì)數(shù)結(jié)果，探討霉菌檢測(cè)過(guò)程中封閉式培養(yǎng)方法的可行性和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus nige，菌株編號(hào)：ATCC 16404）購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。38 個(gè)不同廠家和批號(hào)的食品樣品購(gòu)自福建省福州市幾個(gè)不同的超市，包括5 種玉米淀粉、4 種馬鈴薯淀粉、1 種小麥淀粉、8 種紫菜、6 種海苔、5 種桂圓干、2 種紅棗干、1 種枸杞、2 種紙皮核桃、1 種開(kāi)心果、3 種白曬花生，編號(hào)依次為SP1～SP38。

沙氏液體培養(yǎng)基（批號(hào)3105358） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)170316）北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌器 日本Hirayamaha公司；微量可調(diào)移液器 德國(guó)Eppendorf公司；Hfsafe1200生物安全柜 中國(guó)上海力申公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱中國(guó)上海悅豐儀器儀表有限責(zé)任公司；BSA224S分析天平德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZQTY-70振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；Bagmixer 400拍擊式均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司；ADKS-1便攜式氧氣檢測(cè)儀 艾特思電子科技有限公司；CVK-UB2超低溫冰箱 日本Sanyo公司；AP-9925抽濾設(shè)備 加拿大Autoscience公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌懸液制備

取冷凍保存的黑曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種至無(wú)菌沙氏液體培養(yǎng)基中，于200 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，再次轉(zhuǎn)接至沙氏液體培養(yǎng)基活化2 次，之后取菌絲球接種于孟加拉紅培養(yǎng)基平皿，28 ℃培養(yǎng)7 d至孢子大量產(chǎn)生后注入適量無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌涂布棒輕輕刮取，使黑曲霉游離于生理鹽水中，再用400 目無(wú)菌紗布過(guò)濾去除營(yíng)養(yǎng)菌絲體，收集孢子懸液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[26]，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果（未給出）用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋孢子懸液，以此獲得菌懸液備用（菌懸液經(jīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得霉菌菌落數(shù)約為2 000 CFU/mL）。

1.3.2 黑曲霉的增殖測(cè)試

取1.3.1節(jié)制備的菌懸液10 mL至1 300 mL無(wú)菌沙氏液體培養(yǎng)基，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min后分裝于13 個(gè)梯度（每梯度均設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，兩組各設(shè)置2 個(gè)平行）的離心管中（編號(hào)分別為1～13），培養(yǎng)基分裝量分別為56、50、40、30、21、18、17、16、15、14、12、10、5 mL，離心管容積為57 mL，此時(shí)13 個(gè)梯度的離心管中空氣與培養(yǎng)基體積比分別為0.02∶1、0.14∶1、0.43∶1、0.90∶1、1.71∶1、2.17∶1、2.35∶1、2.56∶1、2.80∶1、3.07∶1、3.75∶1、4.70∶1、10.40∶1。分裝完畢后，旋緊離心管蓋（使離心管處于密封狀態(tài)），之后轉(zhuǎn)移至振蕩培養(yǎng)箱中于200 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)照組定期做透氣處理（每3 h，于生物安全柜中，將對(duì)照組的離心管蓋旋開(kāi)靜置5 min后旋緊，繼續(xù)于200 r/min、28 ℃培養(yǎng)）。實(shí)驗(yàn)組不做透氣處理。

培養(yǎng)結(jié)束后將離心管內(nèi)所有培養(yǎng)物全部抽濾至微孔濾膜（濾膜孔徑為0.45 μm，且事先60 ℃干燥3 h，并稱(chēng)量質(zhì)量），再用一片微孔濾膜將培養(yǎng)物覆蓋，并用等體積的無(wú)菌超純水沖洗3 次，再次60 ℃干燥3 h后稱(chēng)量質(zhì)量，獲得不同離心管黑曲霉增殖的凈質(zhì)量。

1.3.3 黑曲霉的氧氣消耗性實(shí)驗(yàn)

配制150 mL孟加拉紅培養(yǎng)基于容積為600 mL的均質(zhì)罐內(nèi)（均質(zhì)罐為圓柱形，底面直徑為10 cm），共制備18 個(gè)梯度，分別編號(hào)為1～18，每個(gè)梯度2 個(gè)平行，包扎后高壓蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基冷卻凝固后備用。梯度1～9為實(shí)驗(yàn)組，分別向均質(zhì)罐注入1 mL菌懸液（1.3.1節(jié)制得），梯度10～18為對(duì)照組，不加菌懸液，之后用乳膠膜密封均質(zhì)罐口，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于28 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、7、10、15 d。培養(yǎng)結(jié)束后于水下收集均質(zhì)灌內(nèi)氣體，并用便攜式氧氣檢測(cè)儀測(cè)定其氧氣體積分?jǐn)?shù)。

1.3.4 黑曲霉的封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)的比對(duì)測(cè)試

將1.3.1節(jié)制備的菌懸液采用GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[23]的方法進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)，共進(jìn)行15 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)同時(shí)進(jìn)行2 組獨(dú)立的測(cè)試，培養(yǎng)時(shí)一組采用GB 4789.15—2016[23]中明示的培養(yǎng)方法（即敞開(kāi)式培養(yǎng)），另一組采用封閉式培養(yǎng)（取1 個(gè)無(wú)菌空培養(yǎng)皿和1 個(gè)凝固的孟加拉紅培養(yǎng)基堆疊放置，共同轉(zhuǎn)移至1 個(gè)無(wú)定形自封袋中，排除多余空氣并封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。此時(shí)空氣與培養(yǎng)基的體積之比約為3∶1，自封袋將目標(biāo)培養(yǎng)皿隔離形成霉菌生長(zhǎng)的相對(duì)獨(dú)立的微環(huán)境，可防止霉菌孢子逃逸至自封袋外部，從而杜絕霉菌孢子的擴(kuò)散污染）。培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)平皿的霉菌菌落數(shù)。

1.3.5 紫菜中霉菌的重復(fù)性測(cè)試

對(duì)編號(hào)為SP14的紫菜樣品進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)，共進(jìn)行9 個(gè)重復(fù)（編號(hào)1～9），每個(gè)重復(fù)同時(shí)進(jìn)行2 組獨(dú)立的測(cè)試，且2 組測(cè)試在培養(yǎng)時(shí)按照1.3.4節(jié)的方法分別采用敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)平皿的霉菌菌落數(shù)。

1.3.6 食品中霉菌的比對(duì)測(cè)試

38 個(gè)不同的食品樣品（編號(hào)依次為SP1～SP38）按照1.3.4節(jié)的方法分2 組分別采用敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

食品中霉菌分布不均勻，且消長(zhǎng)規(guī)律不定，因此在重復(fù)測(cè)試中數(shù)據(jù)的差異較大，而常規(guī)的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差以及不確定度評(píng)估等方法不適用于霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的比對(duì)分析。鑒于實(shí)際需要，業(yè)內(nèi)普遍參考標(biāo)準(zhǔn)[27]中r（重復(fù)性相關(guān)系數(shù)）和R（復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)）兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)也將R（R=｜lgX－lgY︱）用于分析霉菌敞開(kāi)式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果的差異。進(jìn)一步采用SPSS 18.0[28]對(duì)兩種培養(yǎng)方法的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t-檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05）。同時(shí)，用OriginPro 8.0繪圖軟件繪制霉菌增殖曲線(xiàn)和氧氣消耗曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉的增殖測(cè)試結(jié)果

按照1.3.2節(jié)中13 個(gè)梯度的測(cè)試經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、抽濾、干燥、稱(chēng)質(zhì)量等步驟后，以空氣與培養(yǎng)基體積比為橫坐標(biāo)，以霉菌增殖凈質(zhì)量與培養(yǎng)基體積比（單位為mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制黑曲霉增殖曲線(xiàn)（圖1）。實(shí)驗(yàn)組的曲線(xiàn)在梯度9（培養(yǎng)基體積15 mL，空氣體積42 mL，空氣與培養(yǎng)基的體積比為2.8∶1）處出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)，此處霉菌生長(zhǎng)發(fā)生顯著變化。在梯度8～1變化中，離心管中培養(yǎng)基的體積逐漸增多（16～56 mL），而實(shí)驗(yàn)組離心管內(nèi)的空氣體積下降迅速（41～1 mL），且吻合了黑曲霉增殖凈質(zhì)量與培養(yǎng)基體積的比值的下降規(guī)律，同時(shí)對(duì)照組的曲線(xiàn)起伏變化不大，而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異僅源自培養(yǎng)過(guò)程中氧氣的供給量，因此氧氣是制約實(shí)驗(yàn)組黑曲霉生長(zhǎng)增殖的瓶頸，實(shí)驗(yàn)組離心管中空氣體積的降低是黑曲霉增殖量的下降的主要原因。隨著空氣與培養(yǎng)基的體積比值的增大，在體積比達(dá)到2.8∶1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組離心管中氧氣含量可滿(mǎn)足黑曲霉生長(zhǎng)的需求，氧氣的限制作用被解除，因此實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組梯度9～13黑曲霉的增殖曲線(xiàn)無(wú)明顯變化。

所以，對(duì)于黑曲霉的封閉式培養(yǎng)，在空氣與培養(yǎng)基的體積比大于2.8∶1的情況下，當(dāng)培養(yǎng)至第5天時(shí)，黑曲霉的生長(zhǎng)不受培養(yǎng)微環(huán)境中初始空氣體積的限制。

圖1 黑曲霉的增殖曲線(xiàn)Fig. 1 Growth curve of A. niger

2.2 黑曲霉的氧氣消耗性實(shí)驗(yàn)

圖2 黑曲霉的氧氣消耗曲線(xiàn)Fig. 2 Oxygen consumption curve of A. niger

在1.3.3節(jié)實(shí)驗(yàn)中，考察黑曲霉在空氣與培養(yǎng)基的體積比為3∶1的條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)氧氣的消耗情況。經(jīng)過(guò)接種、培養(yǎng)、測(cè)定氧氣體積分?jǐn)?shù)等步驟后，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)結(jié)束后均質(zhì)罐內(nèi)氣體的氧氣體積分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，繪制氧氣消耗曲線(xiàn)（圖2）。圖2顯示實(shí)驗(yàn)組（梯度1～9）在培養(yǎng)0～2 d，氧氣消耗緩慢（氧氣體積分?jǐn)?shù)為20.5%左右），此時(shí)黑曲霉可能處于“調(diào)整期”，其細(xì)胞進(jìn)行代謝調(diào)配以適應(yīng)新的環(huán)境，為后期快速增殖做準(zhǔn)備；之后，黑曲霉便進(jìn)入了“對(duì)數(shù)期”，其細(xì)胞快速分裂增殖，同時(shí)消耗大量的氧氣，造成了在培養(yǎng)3～7 d的時(shí)間內(nèi)，氧氣體積分?jǐn)?shù)迅速下降（20.5%降至15.2%）；在培養(yǎng)7 d之后，黑曲霉細(xì)胞受各方面因素的影響而進(jìn)入“穩(wěn)定期”，代謝活動(dòng)變慢，因此氧氣體積分?jǐn)?shù)下降較慢。而對(duì)照組（梯度10～18）的氧氣體積分?jǐn)?shù)維持不變（20.9%），說(shuō)明培養(yǎng)微環(huán)境中氧氣體積分?jǐn)?shù)的變化僅源于黑曲霉細(xì)胞的代謝活動(dòng)。

因此，對(duì)于黑曲霉的封閉式培養(yǎng)，在空氣與培養(yǎng)基體積比為3∶1的條件下，當(dāng)培養(yǎng)至第5天時(shí)，氧氣消耗曲線(xiàn)（圖2）未顯示培養(yǎng)微環(huán)境中初始空氣體積能顯著影響黑曲霉的增殖。

2.3 黑曲霉封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)的比對(duì)

統(tǒng)計(jì)1.3.4節(jié)中1∶100稀釋度的孟加拉紅平皿的霉菌菌落數(shù)，并計(jì)算兩個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均值（Xi與Yi）和標(biāo)準(zhǔn)差（σXi與σYi）結(jié)果如表1所示。計(jì)算15 個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差（σXi與σYi）的差值（表1），其中2 個(gè)重復(fù)（編號(hào)5、14）的標(biāo)準(zhǔn)差相同，而5 個(gè)重復(fù)的σXi大于σYi，53%的重復(fù)的σXi小于σYi，因此σXi－σYi的值較均勻的分布于0的兩側(cè)，說(shuō)明兩種培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度無(wú)明顯差異。

根據(jù)1.4節(jié)計(jì)算敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)Ri（Ri=｜lgXi－lgYi︱），如表1所示，所有重復(fù)的復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均小于0.25，滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)[27]要求，說(shuō)明敞開(kāi)式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)對(duì)于菌懸液中黑曲霉的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異。

表1 黑曲霉敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison between open culture and closed culture of A. niger

2.4 紫菜中霉菌的重復(fù)性

1.3.5 節(jié)進(jìn)行的紫菜（樣品SP14）中霉菌計(jì)數(shù)，結(jié)果如表2所示，其中顯示了1∶100稀釋度的樣品稀釋液的兩個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均值（Mj、Nj）和標(biāo)準(zhǔn)差（σMj、σNj），并分別計(jì)算了9 個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差的差值（σMjσNj），其中大于0的值有5 個(gè)（分別為3、5、6、7、8）、小于0的值為4 個(gè)。因此σMj－σNj值較均勻地分布于0的兩側(cè)，說(shuō)明對(duì)于紫菜中霉菌的計(jì)數(shù)，敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度無(wú)明顯差異。

計(jì)算敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)的復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)Rj’（Rj’=｜lgMj－lgNj︱）。表2顯示9 次重復(fù)測(cè)試中復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)的最大值為0.220（編號(hào)8），均符合標(biāo)準(zhǔn)[27]關(guān)于復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)不大于0.45的要求，因此對(duì)于紫菜中霉菌的檢測(cè)，敞開(kāi)式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異。

表2 紫菜中霉菌的敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison between open culture and closed culture of mold in laver

2.5 食品中霉菌的比對(duì)測(cè)試結(jié)果

在38 個(gè)不同食品樣品（1.3.6節(jié)）的霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果中，22 個(gè)樣品的孟加拉紅平皿無(wú)菌落生長(zhǎng)，因此不用于后續(xù)分析，其余16 個(gè)樣品的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示，其中顯示了不同稀釋度樣品稀釋液的兩個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均值（Pk、Qk）和標(biāo)準(zhǔn)差（σPk、σQk）。16 個(gè)樣品的σPk－σQk的值中，有6 個(gè)大于0（分別為SP3、SP4、SP7、SP11、SP33、SP37）、2 個(gè)等于0、8 個(gè)小于零，較均勻地分布于0的兩側(cè)，說(shuō)明對(duì)于食品中霉菌的計(jì)數(shù)，敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度無(wú)明顯差異。

之后計(jì)算敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)的復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)Rk”（Rk”=｜lgPk－lgQk︱）。16 個(gè)樣品中復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)的最大值為0.138（樣品SP25），因此16 個(gè)樣品均符合標(biāo)準(zhǔn)[27]關(guān)于復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)不大于0.45的要求，所以對(duì)于食品中霉菌的檢測(cè)，敞開(kāi)式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異。

表3 食品中霉菌的敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)比對(duì)結(jié)果Table 3 Comparison between open culture and closed culture of mold in food

2.6 敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差的配對(duì)t-檢驗(yàn)

采用1.4節(jié)統(tǒng)計(jì)分析方法分別對(duì)敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差（σXi與σYi、σMj與σNj、σPk與σQk）進(jìn)行配對(duì)t-檢驗(yàn)，以分析兩種培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)結(jié)果精密度差異的顯著性（P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著[29]）。

配對(duì)t-檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示，其中顯示3 次測(cè)試（1.3.4、1.3.5、1.3.6節(jié)）的P值分別為0.532、0.894、0.672，均大于0.05，說(shuō)明封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果精密度差異不顯著，即對(duì)于食品中霉菌的檢測(cè)，封閉式培養(yǎng)方法與敞開(kāi)式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

表4 敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)差的配對(duì)t-檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Paired t-test results of standard deviations between open culture and closed culture

2.7 敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的配對(duì)t-檢驗(yàn)

采用1.4節(jié)統(tǒng)計(jì)分析方法分別對(duì)敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)結(jié)果（Xi與Yi、Mj與Nj、Pk與Qk）進(jìn)行配對(duì)t-檢驗(yàn)（在配對(duì)t-檢驗(yàn)前需將培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以使其符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布[30]），配對(duì)t-檢驗(yàn)結(jié)果如表5所示。其中顯示3 次測(cè)試的P值分別為0.281、0.105、0.681，均大于0.05，說(shuō)明封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果的差異不顯著[29]，即對(duì)于食品中霉菌的檢測(cè)，封閉式培養(yǎng)方法與敞開(kāi)式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

表5 敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的配對(duì)t-檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Paired t-test results of open culture and closed culture

3 討 論

在GB 4789.28—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[31]中，黑曲霉（菌株編號(hào)：ATCC 16404）被用于孟加拉紅培養(yǎng)基的技術(shù)性驗(yàn)收和質(zhì)量控制，因此，黑曲霉在孟加拉紅培養(yǎng)基的定量測(cè)試數(shù)據(jù)具有廣泛的代表性，以其為介質(zhì)的研究結(jié)果，在一定程度上可以推廣至食品中霉菌的計(jì)數(shù)。

通過(guò)1.3.2節(jié)的測(cè)試，獲得了黑曲霉的增殖曲線(xiàn)（圖1），對(duì)于黑曲霉的封閉式培養(yǎng)，在空氣與培養(yǎng)基的體積比大于2.8∶1的情況下，當(dāng)培養(yǎng)至第5天時(shí)，黑曲霉的生長(zhǎng)不受培養(yǎng)微環(huán)境中初始空氣體積的限制。而黑曲霉對(duì)氧氣的消耗性實(shí)驗(yàn)（1.3.3節(jié)）結(jié)果顯示在空氣與培養(yǎng)基體積比為3∶1的條件下，當(dāng)培養(yǎng)至5 d時(shí)，氧氣消耗曲線(xiàn)（圖2）未顯示培養(yǎng)微環(huán)境中初始空氣體積能顯著影響封閉式培養(yǎng)過(guò)程中黑曲霉的生長(zhǎng)。因此將封閉式培養(yǎng)的空氣與培養(yǎng)基的體積比為3∶1，以進(jìn)行后續(xù)的霉菌封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)的比對(duì)測(cè)試。

通過(guò)3 次測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)差分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于封閉式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差大于敞開(kāi)式培養(yǎng)的比例，1.3.4節(jié)中為53%、1.3.5節(jié)中為44%、1.3.6節(jié)中為50%，說(shuō)明兩種培養(yǎng)方法的標(biāo)準(zhǔn)差的差異不明顯。而敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)差配對(duì)t-檢驗(yàn)（2.6節(jié)）結(jié)果顯示，3 次測(cè)試的P值分別為0.532、0.894、0.672（表4），均大于0.05，說(shuō)明封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度差異不顯著，即對(duì)于食品中霉菌的檢測(cè)，封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的精密度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

敞開(kāi)式培養(yǎng)與封閉式培養(yǎng)的復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（包括Ri、Rj’、Rk”）計(jì)算結(jié)果顯示，表1中復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)的最大值為0.144（編號(hào)13），表2中的最大值為0.220（編號(hào)8），表3中最大值為0.138（樣品SP25），3 次測(cè)試中所有的復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均符合標(biāo)準(zhǔn)[27]關(guān)于復(fù)現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R不大于0.45的要求。說(shuō)明對(duì)于食品中霉菌的檢測(cè)，敞開(kāi)式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異。2.7節(jié)中封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的配對(duì)t-檢驗(yàn)的結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了此問(wèn)題，表5中3 次測(cè)試的P值（分別為0.281、0.105、0.681）均大于0.05，說(shuō)明封閉式培養(yǎng)與敞開(kāi)式培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果的差異不顯著，即對(duì)于食品中霉菌的檢測(cè)，敞開(kāi)式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng)對(duì)同一樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示：在空氣與培養(yǎng)基體積比為3∶1的條件下，對(duì)于霉菌的檢測(cè)，封閉式培養(yǎng)方法與標(biāo)準(zhǔn)中明示的敞開(kāi)式培養(yǎng)方法的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別，二者具有相同的代表性和準(zhǔn)確性。據(jù)此可以建立以空氣與培養(yǎng)基的體積比不小于3為參數(shù)的霉菌的封閉式培養(yǎng)方法，該方法用自封袋將目標(biāo)培養(yǎng)皿隔離形成霉菌生長(zhǎng)的相對(duì)獨(dú)立的微環(huán)境，以防止霉菌孢子逃逸至自封袋外部，從而杜絕霉菌孢子的擴(kuò)散污染。用建立的封閉式培養(yǎng)方法取代傳統(tǒng)的敞開(kāi)式培養(yǎng)方法，可以解決霉菌檢測(cè)中孢子擴(kuò)散及污染的難題。因此本研究結(jié)果不僅具有較佳的理論價(jià)值，還有極其重要的實(shí)用價(jià)值。該成果還可以廣泛的推廣至各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室以及相關(guān)企業(yè)用于食品品質(zhì)的監(jiān)督與評(píng)價(jià)，也有助于我國(guó)霉菌相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的完善，以及國(guó)家監(jiān)督水平的提高。