隔藥餅灸對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠外周血中中性粒細(xì)胞的影響

孫 璐，譚 靜，陽(yáng)仁達(dá)，李雙艷，廖宗力，魏 星，羅 明

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）是氣管、支氣管黏膜及其周?chē)M織的慢性非特異性炎癥［1］，臨床主要以咳嗽、咳痰或伴有喘息等為主要癥狀，時(shí)間連續(xù)2年或2年以上，每年持續(xù)3個(gè)月以上［2］，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)的“咳嗽”“痰飲”及“喘證”等范疇，是一種嚴(yán)重危害身體健康的常見(jiàn)疾病。中性粒細(xì)胞為吞噬細(xì)胞固有免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，作為一種吞噬細(xì)胞，具有吞噬與殺菌功能，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在機(jī)體抗感染免疫中通過(guò)吞噬并殺滅微生物而發(fā)揮重要作用，是固有免疫細(xì)

胞的主力軍［3］。灸法治療疾病時(shí)以其產(chǎn)生的溫?zé)嵝?yīng)來(lái)取得療效，現(xiàn)臨床應(yīng)用較廣。本實(shí)驗(yàn)采用的隔藥餅灸指將中藥研末后加入少量賦形劑制成小餅狀，并隔此藥餅用艾炷或艾條灸的一種灸法，本研究旨在探討隔藥餅灸預(yù)處理對(duì)慢性支氣管炎大鼠外周血中PMN的影響并探索其治療慢性支氣管炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康SD大鼠48只（體重200～250 g），月齡3～4個(gè)月，雌雄各半。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、穴位隔藥餅灸組、核酪口服液對(duì)照組4組，每組12只。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（湘）2017-0003］，保持飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 核酪口服液：上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：170205；艾炷：選用“神灸300灸”由艾炷蘇州東方艾絨廠(chǎng)出產(chǎn)（型號(hào)：東方1型）；玉屏風(fēng)散：黃芪、白術(shù)（炒）、防風(fēng)按 2∶2∶1的比例稱(chēng)取，所用中藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，上三味藥烘干，粉碎后過(guò)200目篩，裝瓶備用。

1.1.3 試劑與儀器 氯化銨溶血?jiǎng)?、多聚甲醛、PBS、水合氯醛、Hank′s液、碘化丙啶標(biāo)記的大腸菌液（長(zhǎng)沙唯爾生物科技有限公司生物試劑經(jīng)部）。JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；常溫低速離心機(jī)（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供）；HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海南陽(yáng)儀器有限公司）；FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司）；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國(guó)LEICA公司）；移液器（德國(guó)Eppendorf公司）；7001×UVI數(shù)字彩色顯微圖像分析系統(tǒng)（Optimas 6.5，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用改良煙熏法復(fù)制慢性支氣管炎大鼠模型［4］。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，空白組置于正常無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)；其余3組均放置于特制的1 m×1 m×1 m的煙室中，用煙葉、鋸末、刨花各50 g，點(diǎn)燃對(duì)大鼠進(jìn)行煙熏，每天上午、下午分別1次，每次30 min，持續(xù)1個(gè)月。造模成功標(biāo)志：大鼠出現(xiàn)咳嗽、喘鳴、呼吸急促，且咳痰質(zhì)地較清稀，口鼻流出黏液性分泌物，并先后出現(xiàn)精神不振，喜靜甚至蜷伏不動(dòng)，行動(dòng)遲緩，痰多，納少，消瘦便溏，體毛脫落，舌色發(fā)青等癥狀和體征。顯微鏡下觀(guān)察：氣管黏膜層、黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，存有分泌物及脫落細(xì)胞；肺內(nèi)細(xì)支氣管可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞。

1.2.2 選穴與干預(yù)方法 選穴：Ⅰ組：肺俞、腎俞；Ⅱ組：關(guān)元、足三里。取穴定位參照十二五規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［5］。

隔藥餅灸組操作方法：于造模成功后開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行隔藥餅灸治療，找準(zhǔn)穴位后剪毛，注意不可損傷皮膚，用100 g/L硫化鈉脫除根部絨毛，將事先準(zhǔn)備好的直徑0.5 cm藥餅放置穴位皮膚上并用膠布固定，點(diǎn)燃進(jìn)行施灸，待艾炷燃畢，再換另外一壯，每穴持續(xù)灸 3～4 壯（20 min），1次/d，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，持續(xù)干預(yù)2 w。核酪口服液組給藥方法：核酪口服液按人體用藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量灌胃，給藥量為2 mL/100 g體重?？瞻捉M及模型組則分別灌服同等體積的生理鹽水。

1.2.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)期間，密切觀(guān)察動(dòng)物的一般狀態(tài)如體重、毛色、精神狀態(tài)等。待治療結(jié)束，禁食不禁水12 h后腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，取各組大鼠抗凝全血2 mL，流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察血液中PMN吞噬指數(shù)。

放血處死大鼠后，取出氣管及肺臟，將氣管和右肺置于4%的甲醛固定液中固定1 d，再用乙醇脫水，石蠟包埋，4～5 μm 切片，進(jìn)行 HE 染色，在光鏡下觀(guān)察各組大鼠支氣管肺組織的病理變化。

外周血中PMN噬吞指數(shù)的檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)，取各組大鼠抗凝全血100 μL，加入到1.5 mL Eppendorf離心管，放置冰上10 min，然后加入1×109/mL 碘化丙啶標(biāo)記的大腸菌液 10～20 μL，混勻，進(jìn)行水浴溫度在37℃，10～15 min后迅速取出放入冰中10 min。把樣本移入流式測(cè)定試管，加冷Hank′s洗滌1次，棄上清，加入氯化銨溶血?jiǎng)? mL，室溫下放置10 min，離心，棄上清液。冷Hank′s再洗滌1次，棄上清液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMN熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算PMN吞噬率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，組間比較方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用 Tamhane′s法進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠整體情況較好，無(wú)咳嗽氣喘等癥狀，精神較好，活動(dòng)靈敏，飲食正常，毛發(fā)柔順光澤，體重?zé)o明顯變化。模型組造模7 d后口鼻流出黏液性分泌物，活動(dòng)后出現(xiàn)咳嗽氣喘、呼吸困難等癥狀，喜靜不喜動(dòng)，反應(yīng)略遲鈍，精神不佳，飲食減少，消瘦便溏，毛發(fā)凌亂無(wú)光澤，體重減輕等癥狀和體征。穴位隔藥餅灸組及核酪口服液對(duì)照組造模后癥狀同模型組，穴位隔藥餅灸組治療后觀(guān)察到大鼠咳嗽氣喘、口鼻分泌物、飲食情況等較前逐漸好轉(zhuǎn)。核酪口服液對(duì)照組癥狀亦有所改善。

2.2 病理組織觀(guān)察結(jié)果

4組大鼠光鏡下觀(guān)察氣管和肺組織的病理改變：空白組肺泡及支氣管均正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管黏膜層及黏膜下層正常，無(wú)炎癥浸潤(rùn)。模型組肺泡擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管黏膜層及黏膜下層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)有脫落細(xì)胞。穴位隔藥餅灸組支氣管及肺泡正常，散在少量炎癥細(xì)胞；氣管黏膜層及黏膜下層正常，有少量散在的炎癥細(xì)胞。核酪口服液組肺泡正常，巨噬細(xì)胞增多；氣管黏膜下層有彌漫性的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁完整，無(wú)脫落。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 氣管和肺組織病理觀(guān)察結(jié)果

2.3 各組大鼠全血PMN吞噬指數(shù)

與空白組比較，模型組PMN吞噬指數(shù)明顯升高（P＜0.01），說(shuō)明慢性支氣管炎大鼠吞噬能力較正常大鼠明顯升高；與模型組比較，穴位隔藥餅灸組、核酪口服液組PMN吞噬指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隔藥餅灸組降低更明顯（P＜0.05），提示隔藥餅灸與核酪口服液組均能降低慢支大鼠PMN吞噬指數(shù)，且隔藥餅灸作用更明顯。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠PMN吞噬指數(shù)變化比較 （±s）

表1 各組大鼠PMN吞噬指數(shù)變化比較 （±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01，與模型組比較，2）P＜0.05；與穴位隔藥餅灸組比較，3）P＜0.05

組別 n PMN吞噬指數(shù)空白組 12 1.90±0組 12 7.63±3.70模型.191）穴位隔藥餅灸組 12 3.79±1.022）核酪口服液組 12 5.57±1.872）3）

3 討論

相關(guān)研究表明，呼吸道疾病的發(fā)病過(guò)程中，患者的呼吸道內(nèi)可能存在活躍的修復(fù)及損傷機(jī)制，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的許多介質(zhì)在這一過(guò)程中起重要作用［6］。中性粒細(xì)胞是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在機(jī)體非特異性免疫防御中起重要作用［7］。中性粒細(xì)胞為吞噬細(xì)胞固有免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，具有趨化、吞噬、呼吸爆發(fā)等生物學(xué)特性［8］。當(dāng)病原體進(jìn)入機(jī)體后，中性粒細(xì)胞開(kāi)始活化，在相關(guān)趨化因子作用下通過(guò)血管的內(nèi)皮細(xì)胞而進(jìn)入血管間隙，隨著血液流動(dòng)到達(dá)感染部位，繼而與病原體接觸后形成偽足并將病原體包圍，中性粒細(xì)胞質(zhì)膜逐漸內(nèi)陷形成吞噬體，繼而發(fā)揮殺滅病原體作用［9］。所以中性粒細(xì)胞在機(jī)體抗感染過(guò)程中通過(guò)吞噬并殺滅微生物而發(fā)揮重要作用。在整個(gè)炎癥反應(yīng)過(guò)程中，中性粒細(xì)胞通過(guò)表面模式識(shí)別受體與相關(guān)分子模式作用而得到激活，然后其受體與表達(dá)在血管內(nèi)皮上的配體相互作用進(jìn)行遷徙，最終通過(guò)吞噬作用和脫顆粒作用對(duì)病原體及損傷組織進(jìn)行清除［10］。由此可知，當(dāng)機(jī)體中的相關(guān)炎癥因子處于上升時(shí)，機(jī)體可能產(chǎn)生一些炎癥反應(yīng)，如機(jī)體呼吸道支氣管內(nèi)出現(xiàn)炎性分泌物，上皮細(xì)胞增厚甚至脫落，繼而出現(xiàn)咳嗽、氣喘等癥狀；通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察得出，穴位隔藥餅灸能明顯降低慢支大鼠PMN吞噬指數(shù)，繼而減輕模型大鼠的炎癥反應(yīng)，減輕臨床癥狀。

艾灸是一種傳統(tǒng)且有效的治療方法，具有溫通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、扶助正氣、散寒止痛等功效，《內(nèi)經(jīng)》中記載，針灸所不能達(dá)到之處，艾灸可以達(dá)到［11］。艾產(chǎn)生效果的可能根本原因是其燃燒時(shí)產(chǎn)生的溫?zé)嵝?yīng)，其基本原理以“溫通”為主。炎性反應(yīng)以“紅、腫、熱、痛”為典型特征，是機(jī)體氣機(jī)阻滯的表現(xiàn)，通過(guò)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)的某些內(nèi)在特征與傳統(tǒng)理論中關(guān)于氣機(jī)失調(diào)、經(jīng)脈阻滯的病理相符合。姜?jiǎng)欧宓龋?2］通過(guò)相關(guān)研究闡述了艾灸抗炎的機(jī)制：艾灸治療的主要病理基礎(chǔ)是炎性反應(yīng)，針對(duì)炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的一些功能障礙、氣血阻滯等病理癥狀，都可以用艾灸的“溫通”效應(yīng)發(fā)揮較好的療效。因此，艾灸的溫通作用可以達(dá)到舒筋活絡(luò)、抗炎止痛等效果，從而用于治療慢性支氣管炎等炎性反應(yīng)病變。張偉等［13］通過(guò)懸灸有效降低了哮喘模型大鼠的中性粒細(xì)胞，從而有效緩解其急性發(fā)作期癥狀，說(shuō)明艾灸可通過(guò)干預(yù)中性粒細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮減輕哮喘的作用。張夢(mèng)雪等［14］在治療非小細(xì)胞肺癌患者時(shí)，發(fā)現(xiàn)麥粒灸療法可使機(jī)體中性粒細(xì)胞走向程序性凋亡，有效緩解患者的相關(guān)炎性反應(yīng)狀態(tài)，減輕其痛苦，并且能提高患者的免疫功能，從而提高其生存質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)在灸的基礎(chǔ)上采用隔藥餅灸，是指在穴位上貼敷藥餅，再將艾炷放于藥餅上，點(diǎn)燃艾柱再進(jìn)行治療的一種方法。穴位隔藥餅灸原理為：艾灸燃燒時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)，加上藥餅中藥物小分子通過(guò)皮膚滲透到皮下甚至毛細(xì)血管，再加上腧穴的治療作用，通過(guò)經(jīng)絡(luò)循行而達(dá)病所，從而起到舒筋活絡(luò)、調(diào)理臟腑的治療效果。王小平等［15］認(rèn)為灸的作用主要是通過(guò)溫?zé)嶙饔?，促使穴位局部毛?xì)血管擴(kuò)張，加速血液循環(huán)，藥餅的有效成分通過(guò)小分子透過(guò)皮膚到達(dá)血液中，沿經(jīng)絡(luò)循行至病所，以驅(qū)散內(nèi)伏寒邪，使肺氣升降恢復(fù)正常，達(dá)到扶正固本的治療目的。此次選穴為肺俞、腎俞、關(guān)元、足三里，以起到扶正祛邪、培本補(bǔ)虛的作用。陳向華等［16］研究發(fā)現(xiàn)艾灸大鼠“肺俞”“腎俞”穴能改善模型大鼠支氣管壁肌層增厚、黏膜水腫情況，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。張余山［17］研究表明，電針患者足三里、關(guān)元穴后，發(fā)現(xiàn)其各項(xiàng)炎癥反應(yīng)指標(biāo)均較治療前顯著下降，可減輕膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)。此次藥餅選方為源自《丹溪心法》的玉屏風(fēng)散，方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味藥物組成，是中醫(yī)扶正固本的經(jīng)典方劑?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，玉屏風(fēng)散加味方可增強(qiáng)模型大鼠SIgA和SC的表達(dá)，降低TNF-α和IL-8等炎性因子的表達(dá)［18］，提示該方藥可干預(yù)氣道炎癥微環(huán)境，調(diào)節(jié)患者免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)。劉海亮等［19］證實(shí)給予玉屏風(fēng)散的小鼠耳炎癥反應(yīng)減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；同時(shí)能顯著降低小鼠耳組織勻漿中 IL-4、IL-5、IL-9、EL-13 水平，對(duì) Th2 型過(guò)敏性炎癥有顯著的抑制作用。通過(guò)查閱多篇文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸利用對(duì)穴位的持續(xù)溫灸加以藥物的滲透作用，達(dá)到溫通氣血、扶正祛邪等效果，使人體消除病痛。其治療效果明顯，深受廣大患者青睞。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：造模以后，模型組PMN吞噬指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；穴位隔藥餅灸及灌服核酪液治療后，大鼠血清PMN吞噬指數(shù)明顯降低（P＜0.05），且隔藥餅灸后降低更明顯（P＜0.05）。綜上所述，慢性支氣管炎大鼠外周血PMN吞噬指數(shù)增高，其炎癥可刺激PMN增多，使其釋放更多的炎癥因子，導(dǎo)致慢支感染反復(fù)，穴位隔藥餅灸及核酪口服液均可降低PMN，穴位隔藥餅灸效果更好。隔藥餅灸可增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力及藥物殺菌作用，這為隔藥餅灸治療慢性支氣管炎提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但其具體調(diào)節(jié)通路信號(hào)有待進(jìn)一步深入研究，且該方法在臨床的可行性亦有待進(jìn)一步認(rèn)識(shí)與研究。