Notch信號通路在間充質干細胞分化成唾液腺腺泡細胞中的作用

程 鋼，黃鄧高，梁 穎，王偉鋒，符先先，袁 峰

0 引言

放射性唾液腺損傷是頭頸部癌癥放射治療后常見的不良反應[1-2]，鼻咽癌是華南地區(qū)高發(fā)腫瘤，放射治療是鼻咽癌的主要根治性手段，97.9%的鼻咽癌患者放療后會發(fā)生放射性唾液腺損傷，臨床表現(xiàn)為口干、吞咽和發(fā)音困難、味覺喪失、念珠菌感染、齲齒等[3-5]。唾液腺由一些腺泡細胞組成，對放射線敏感，放射性唾液腺損傷主要是損傷腺泡細胞[6-7]。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有向不同胚層細胞增殖和分化的能力，有研究報道其已誘導出神經(jīng)細胞、脂肪細胞、骨細胞等[8-9]，向唾液腺腺泡細胞的分化也有動物細胞實驗獲得了成功，為臨床唾液腺腺泡細胞損傷的修復開辟了一個新的治療方法[10]。本研究觀察了Notch信號通路在骨髓MSCs分化成唾液腺腺泡細胞過程中的作用，為MSCs分化成腺泡細胞的調(diào)控提供更多的靶分子。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 40只1周齡健康雄性SD大鼠和40只6～8周齡健康雄性SD大鼠購自海南醫(yī)學院動物實驗中心，DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司，Notch、α-淀粉酶抗體購自美國Cell Signal公司，F(xiàn)ITC標記二抗購自美國RD公司，免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物科技技術有限公司，分層培養(yǎng)Transwell小室購自美國Corning 公司。細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 骨髓MSCs的分離和鑒定 用頸椎脫臼法處死6～8周健康SD大鼠，無菌分離股骨及脛骨，剪斷兩端，注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，24 h后去除懸浮細胞，保留貼壁細胞。MSCs的鑒定采用驗證其向脂肪細胞分化的潛能，貼壁細胞加入誘導劑繼續(xù)培養(yǎng)2周，油紅-O染色觀察脂肪細胞分化情況。

1.3 唾液腺腺泡細胞的分離和鑒定 用頸椎脫臼法處死1周齡健康SD大鼠，75%酒精浸泡5 min，摘除雙側頜下腺，去除腺體周圍被膜、脂肪和結締組織，將腺體剪成1 mm3左右組織塊，0.125%Ⅱ型膠原酶37 ℃水浴消化40 min，吹打組織制備細胞懸液，培養(yǎng)于腺細胞專用培養(yǎng)基，利用差速黏附法純化腺泡細胞，純化的細胞爬片后，4%多聚甲醛固定，免疫組織化學染色，α-淀粉酶染色陽性為腺泡細胞。

1.4 骨髓MSCs的誘導分化 Transwell小室分上下2層，中間有生物膜相隔，上下層細胞不會接觸，但細胞分泌的因子可相互影響。實驗分為誘導分化組和對照組，誘導分化組：上層MSCs、下層腺泡細胞，MSCs∶腺泡細胞=1∶4，對照組：上下層均是MSCs，1×104/孔。培養(yǎng)2周后，收集細胞上層MSCs細胞，流式細胞儀檢測淀粉酶抗體染色陽性的MSCs向腺泡細胞分化情況。

1.5 Notch蛋白的檢測 實驗分為4組，每組各10只。A組：上下層均是MSCs；B組：上層MSCs和下層腺泡細胞共培養(yǎng)；C組：上層MSCs和下層腺泡細胞共培養(yǎng)，加入Notch激活劑Jagged1；D組：上層MSCs和下層腺泡細胞共培養(yǎng)，加入Notch抑制劑DAPT。培養(yǎng)2周后，收獲上層MSCs，Western blot測定Notch蛋白表達情況，SDS-PAGE凝膠分離蛋白，電轉膜后，封閉液孵育膜1 h，加入Notch1抗體過夜孵育，加入二抗孵育2 h，化學發(fā)光法檢測Notch蛋白表達。流式細胞儀檢測不同分組上層MSCs向腺泡細胞分化情況。

1.6 腺泡細胞的流式細胞儀檢測 制備的單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，取200 μl加入淀粉酶抗體一抗和FITC標記二抗，室溫孵育1 h，流式細胞儀檢測抗體標記陽性細胞所占的比例，簡述如下：前向散射光和側向散射光做門R1，去除細胞碎片，關聯(lián)R1，F(xiàn)L1通道設置R2，檢測FITC陽性細胞的比例。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件，兩組獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Transwell小室共培養(yǎng)誘導了MSCs向腺泡細胞分化 分離的骨髓MSCs貼壁生長，均一的長梭形，誘導2周后油紅-O染色，胞漿內(nèi)可見紅色脂滴。制備的唾液腺腺泡細胞差速黏附法去除成纖維細胞，細胞鋪滿培養(yǎng)皿6～8 d傳代1次，第3代時細胞爬片，α-淀粉酶免疫組化染色，見細胞α-淀粉酶陽性。Transwell小室混合培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測小室上層MSCs中α-淀粉酶陽性的腺泡細胞比例，結果顯示，誘導分化組α-淀粉酶陽性細胞的比例為52.34%±8.26%，對照組未檢測到陽性細胞。見圖1。

圖1 對照組(A)、誘導分化組(B)腺泡細胞的流式細胞儀檢測

2.2 Notch蛋白在MSCs向腺泡細胞分化中的作用 從圖2可見，B組Notch蛋白表達量顯著高于A組。C組Notch蛋白表達量顯著高于B組。D組Notch蛋白表達量顯著高于B組。從表1可見，流式細胞儀檢測A、B、C、D組上層MSCs中α-淀粉酶染色陽性腺泡細胞的比例分別為0、52.34%±8.26%、66.72%±9.43%、38.55%±6.81%，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 Notch信號的Western blot檢測

注：A.上下層均為MSCs；B.上層MSCs和下層腺泡細胞；C.上層MSCs和下層腺泡細胞，加入Jagged1；D.上層MSCs和下層腺泡細胞，加入DAPT

表1 不同分組MSCs向腺泡細胞分化的比較

注：*與A組比較，P<0.01；#與B組比較，P<0.05；△與C組比較，P<0.01

3 討論

放射性唾液腺損傷的機制目前尚不明確，因此，仍然缺少特效的預防和治療方法[11-12]，臨床上的治療多是針對癥狀的姑息性治療，例如，使用唾液替代物或唾液分泌刺激膽堿能劑。代用品幾乎不可能復制天然唾液的所有功能，膽堿能藥物雖然可以刺激未受損腺體的天然唾液分泌，但是長期服用后的出汗、過度流淚和胃腸道疼痛等不良反應，給患者的生活帶來新的不利影響[13-15]。

MSCs最大的特點是在合適的條件可分化為各種來源的細胞，其作為種子細胞越來越多地應用于醫(yī)學領域[16-17]。祁荊荊等[18]在頜下腺注射間充質干細胞治療干燥綜合征，發(fā)現(xiàn)了修復受損腺泡細胞的作用。筆者前期動物實驗研究顯示，骨髓間充質干細胞可以發(fā)揮治療小鼠放射性唾液腺損傷作用[19]。本研究在此基礎上也構建了誘導MSCs分化成唾液腺腺泡細胞的3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，結果顯示，誘導分化2周后，52.34%±8.26%的MSCs分化為α-淀粉酶陽性細胞的腺泡細胞，與梁亮等[20]的轉化效率相接近。研究MSCs向腺泡細胞分化的機制，對于提高轉化效率具有積極的意義[21]。王繼榮等[22]研究顯示，Notch信號在骨髓MSCs的分化過程中發(fā)揮著重要的作用，Notch信號通路廣泛存在于動物和人體，進化上高度保守，參與胚胎、細胞發(fā)育。維持造血干細胞的自我更新，調(diào)節(jié)血管生成，其主要的生理功能體現(xiàn)在調(diào)節(jié)細胞分化與組織發(fā)育上[23-24]。Notch信號通路對MSCs的分化起重要的調(diào)節(jié)作用，Notch通路可促進MSCs向成骨細胞分化，Notch通路的激活是啟動軟骨細胞分化的關鍵[25-26]。圖1顯示，B組Notch蛋白表達量顯著高于A組，說明上層MSCs和下層腺泡細胞共培養(yǎng)較單獨的MSCs 培養(yǎng)Notch蛋白表達量升高，存在Notch通路的激活。C組Notch蛋白表達量顯著高于B組，說明加入Notch信號激活劑后，蛋白的表達顯著升高。D組Notch蛋白表達量顯著高于B組，說明加入Notch信號抑制劑后，蛋白的表達顯著減低。流式細胞儀的檢測結果也顯示，Notch通路的激活可能在誘導上層MSCs向腺泡細胞分化過程中發(fā)揮了作用，隨后加入Notch信號激活劑或抑制劑后，MSCs向腺泡細胞分化的比例也會相應增強或減弱。提示Notch通路的激活在誘導MSCs向腺泡細胞分化的過程中發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)Notch通路有可能調(diào)節(jié)MSCs轉化為唾液腺腺泡細胞的效率。

綜上所述，MSCs向唾液腺腺泡細胞分化過程中Notch通路激活，激活或抑制Notch通路可以增強或減弱MSCs轉化為唾液腺腺泡細胞的效率。但是本研究僅僅是體外實驗階段，體內(nèi)注入MSCs后，能否到達唾液腺分化為腺泡細胞，還有待進一步實驗來證實。