基于新一代測序技術(shù)的易栓癥基因檢測Panel的建立及其在中國靜脈血栓患者遺傳背景研究中的臨床應(yīng)用

李 蕾， 吳 希， 許冠群， 梁 茜， 戴 菁， 武文漫， 丁秋蘭， 王鴻利， 王學鋒,3

(1．上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院 醫(yī)學基因組國家重點實驗室 上海血液學研究所，上海 200025；2．上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；3．上海交通大學醫(yī)學院檢驗系，上海 200025）

易栓癥是指由于遺傳性或獲得性原因?qū)е聶C體容易發(fā)生血栓的一種病理生理過程，臨床上以靜脈血栓（venous thromboembolism,VTE）更為多見，如下肢深靜脈血栓、肺栓塞等[1]。遺傳性易栓癥占易栓癥的30%～50%，其中的抗凝血酶（antithrombin,AT）、蛋白 C（protein C，PC）和蛋白 S（protein S，PS）缺陷是我國VTE人群最主要的遺傳性危險因素[2-4]，此外，編碼凝血因子、纖溶蛋白、富組氨酸糖蛋白等的基因發(fā)生突變也可能會引起易栓傾向[5-8]。由于遺傳性危險因素攜帶終生，對其進行明確診斷對患者及其家系成員有效的抗凝治療及VTE預(yù)防具有重要意義。

傳統(tǒng)的遺傳性易栓癥診斷主要依賴表型檢測，當表型檢測結(jié)果異常時，再針對相關(guān)基因進行以一代測序技術(shù)為基礎(chǔ)的基因檢測，尋找是否存在致病突變。然而，表型診斷有諸多局限性，如只能檢測血漿中的蛋白成分，當患者處于血栓急性期或口服抗凝藥物期間會影響檢測結(jié)果的準確性，且表型檢測由于方法學上的局限性，很難反映被檢蛋白的全部情況[1]，且有些VTE發(fā)生相關(guān)的蛋白尚無有意義的表型檢測方法，如血栓調(diào)節(jié)蛋白、內(nèi)皮細胞PC受體、肝素輔因子Ⅱ等[9-11]。目前，不斷有新的遺傳性血栓危險因素被報道[12]，基因拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）也被證實與血栓的發(fā)生密切相關(guān)[13-14]，這提示傳統(tǒng)的遺傳性易栓癥診斷方式已無法滿足現(xiàn)階段的臨床診斷需求。

新一代測序技術(shù)的發(fā)展為易栓癥遺傳背景檢測打開了新的局面，實現(xiàn)了同時對多個基因或目的區(qū)域進行快速有效地基因檢測。上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院設(shè)計了適用于我國VTE患者的易栓癥基因檢測Panel，共包含了18種與血栓發(fā)生相關(guān)的候選基因，采用二代測序和CNVplex?技術(shù)對基因的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)進行點突變、小缺失或插入及CNV的檢測，結(jié)合生物信息學手段對測序結(jié)果進行深度分析，進而確定相關(guān)基因的變異情況。本研究利用該Panel對前期收集的VTE患者進行了基因檢測，不僅驗證了該Panel應(yīng)用于臨床診斷的可行性，同時調(diào)查了我國VTE患者的遺傳背景。

資料與方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2018年6月期間就診于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院血栓與止血門診、并經(jīng)影像學方法檢測（多普勒超聲、靜脈造影及肺動脈CT等）確診患有VTE的患者[3]，這些患者來自我國各地，以華東和華南地區(qū)為主,絕大多數(shù)為漢族人，通過對其病史、家族史等進行評估，篩選出發(fā)病年齡＜50歲或復(fù)發(fā)型VTE或罕見部位（上肢深靜脈血栓、淺靜脈血栓、顱內(nèi)靜脈竇血栓及門靜脈系統(tǒng)血栓等）的VTE患者，同時排除處于腫瘤活動期的患者，最終本研究共納入246例VTE患者。

二、方法

1.易栓癥的表型檢測：采集患者的靜脈血，置于 1∶9抗凝的枸櫞酸鈉抗凝管中，2 000×g離心15 min分離血漿和血細胞。采用ACL-TOP全自動血凝儀（IL公司,美國）對患者血漿中的凝血因子、抗凝蛋白、纖溶蛋白及狼瘡抗凝物進行檢測，其中凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ及 PS活性采用凝固法測定；血管性血友病因子抗原及活性測定采用免疫比濁法，AT、PC和纖溶酶原活性采用發(fā)色底物法測定；狼瘡抗凝物采用稀釋的蝰蛇毒時間法測定；抗心磷脂抗體和抗β2糖蛋白Ⅰ采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。

2.易栓癥基因檢測Panel：遺傳性易栓癥可由多種基因突變導(dǎo)致。本研究主要檢測VTE患者的抗凝蛋白、凝血因子及纖溶相關(guān)蛋白等是否存在基因突變導(dǎo)致其功能障礙。根據(jù)目前已知的文獻報道[15]，全基因組關(guān)聯(lián)分析證實有17種基因與靜脈血栓發(fā)生相關(guān)；本研究又通過在人類孟德爾遺傳學數(shù)據(jù)庫 （Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）中檢索“thrombophilia”、“venous thromboembolism”及“deep venous thrombosis”等關(guān)鍵詞，最終遴選出18種與易栓癥或靜脈血栓發(fā)生相關(guān)的基因，組成了易栓癥基因檢測Panel（見表1）。突變篩查涉及到2種高通量檢測技術(shù)，其中點突變或小缺失/插入的檢測使用以新一代測序為基礎(chǔ)的目的區(qū)域富集測序技術(shù)，而CNV的檢測采用CNVplex?高通量拷貝數(shù)檢測技術(shù)。

（1）多重目的區(qū)域富集測序及分析：采用Fast-TargetTM富集技術(shù)（天昊生物科技，上海），針對18種基因的啟動子區(qū)域、5′和3′非編碼區(qū)、編碼區(qū)、剪切位點附近序列設(shè)計多重PCR擴增體系，富集目的片段；再利用Illumina Hiseq測序儀 （Illumina，美國）的2×150 bp測序模式對目的片段進行雙向測序驗證；最后，通過生物信息學手段對測序結(jié)果進行測序深度分析[16]。在檢出的基因變異中，先去除在dbSNP135數(shù)據(jù)庫中有記錄或在千人基因組項目里面我國漢族人群中的頻率≥1%的單核苷酸變異；然后采用 PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster軟件對非同義單核苷酸變異的功能進行預(yù)測，如果2個及以上軟件認為突變具有致病性，即將該突變歸為致病突變；剪切位點突變采用Alamut v2.7對正常剪切的影響進行預(yù)測，如果2個及以上軟件認為突變具有致病性，則將其歸為致病突變；最后，篩選出的突變通過一代測序進行驗證，進而確定樣品中易栓癥相關(guān)基因的外顯子、剪切點區(qū)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的點突變變異情況。

（2）CNVplex?高通量拷貝數(shù)檢測：采用CNVplex?高通量拷貝數(shù)檢測技術(shù)（天昊生物科技，上海）對上述18種基因的目的區(qū)域進行高通量CNV檢測。首先，采用連接酶高特異性連接反應(yīng)對上述目的區(qū)域進行雜交、連接，通過在連接探針末段引入不同長度的標簽序列獲得長度各異的目的探針連接產(chǎn)物，利用熒光標記的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，通過熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離檢測，最后通過對電泳圖譜的分析獲取各個位點的峰高，進而對樣品目的區(qū)域的拷貝數(shù)進行分析確定。

3.生物學意義分析：參考美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會對基因變異致病性的分類標準[17]，已有文獻報道與VTE發(fā)病有關(guān)的突變定義為“致血栓”的突變；新的點突變、剪切位點突變，結(jié)合軟件預(yù)測結(jié)果及表型結(jié)果，顯示相關(guān)蛋白功能異常且與VTE相關(guān)時，可將其歸類為“致血栓”的突變。其他與VTE無明確相關(guān)性的基因變異定義為“致病性不明確”的變異。

表1 易栓癥基因檢測Panel包含的18種基因

結(jié) 果

一、對象的基本資料

本研究納入246例VTE患者，男性173例，女性 73例，首次發(fā)病年齡為（34.3±13.2）歲。 46.3%（114/246）的患者曾反復(fù)發(fā)生VTE，約25%的患者伴有獲得性血栓危險因素，如抗磷脂綜合征、外科手術(shù)、長期臥床或妊娠等。

二、篩查對象的基因檢測結(jié)果

經(jīng)易栓癥基因檢測 Panel發(fā)現(xiàn)，64.6%（159/246）的患者攜帶基因突變，其他87例患者未檢測到突變。在攜帶突變的患者中，69.2%（110/159）攜帶單一基因突變，13.2%（21/159）攜帶單基因的復(fù)合雜合突變，17.6%（28/159）攜帶2種及以上的基因突變 （見圖1）。根據(jù)突變類型分類，88%（140/159）的患者僅攜帶點突變、小缺失或插入，5.7%（9/159）的患者僅攜帶基因拷貝數(shù)變異，另外6.3%（10/159）的患者兩者均攜帶。

圖1 246例靜脈血栓栓塞患者的易栓癥基因檢測Panel結(jié)果

本研究建立的易栓癥基因檢測Panel中，有6種基 因 （PROCR、THBD、SERPIND1、TFPI、HRG 和ADAMTS13）目前尚缺乏有意義的表型指標，只能通過基因檢測、生物信息學分析及體外實驗對其功能進行分析。其次，有72例患者因處于血栓急性期或口服抗凝藥物期間，無法進行表型檢測，經(jīng)易栓癥基因檢測Panel分析發(fā)現(xiàn)，其中32例患者攜帶致病性基因突變。另有56例患者的實驗室表型檢測結(jié)果均為正常，而易栓癥基因檢測Panel結(jié)果顯示其中20例患者攜帶致病性基因突變。

1.攜帶單基因單個突變患者的表型及基因檢測結(jié)果：本研究中共有110例患者攜帶單一基因突變，平均年齡為（33.7±12.6）歲，其中半數(shù)的患者曾多次發(fā)生VTE，四分之一的患者合并獲得性血栓危險因素，如抗磷脂綜合征、妊娠或外科手術(shù)等。如表2所示，96例患者攜帶抗凝蛋白突變，其中90例患者攜帶點突變、小缺失或插入，6例患者攜帶基因拷貝數(shù)變異?？鼓鞍淄蛔冎杏?1個突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)，經(jīng)表型驗證均為致血栓性突變。另外，有5例患者攜帶凝血因子突變，其中有1例年輕男性患者，反復(fù)發(fā)生VTE，家族史陽性，但易栓癥表型檢測均未發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)易栓癥基因Panel檢測發(fā)現(xiàn)其攜帶F2基因Arg596Gln突變 （已有研究表明該突變導(dǎo)致抗凝血酶抵抗，是VTE的嚴重危險因素[18-19]）。還有一例14歲的VTE患者攜帶F9基因Arg384Gln突變 （體外研究表明該突變導(dǎo)致凝血因子Ⅸ活性顯著升高，為VTE的危險因素之一）。此外，還有2例F5突變、1例F12突變、4例PROCR突變、2例THBD突變、2例SERPIND1突變和1例PLG突變的致病性需要進一步行功能性實驗以驗證。

表2 攜帶單基因單個突變患者的表型及基因檢測結(jié)果（n）

2.攜帶單基因復(fù)合雜合突變患者的表型及基因檢測結(jié)果：本研究中有21例患者攜帶單基因復(fù)合雜合突變（見表 3），首次發(fā)病年齡為（31.4±11.5）歲，81%的患者曾發(fā)生無明顯誘因的VTE事件，57%的患者曾反復(fù)發(fā)生VTE。有17例患者為PROC復(fù)合雜合突變，PC活性在15%至90%之間，其中有14例患者攜帶中國人群的PROC熱點突變 （R189W或K192del）。另外，有4例患者攜帶PROS1復(fù)合雜合突變，PS活性顯著下降 （18%～38%），其中3例攜帶中國人群的PS熱點突變（E67A或R561W）。在這21例患者中，共有11例患者攜帶新的基因突變，包括8種PROC新突變和3種PROS1新突變，通過對患者家系中攜帶相同突變的成員進行表型驗證后證實，以上新突變均會導(dǎo)致受累者的PC或PS活性下降，為致血栓性突變。家系調(diào)查顯示，以上患者所攜帶的復(fù)合雜合突變均來源于其父母。

表3 攜帶單基因復(fù)合雜合突變患者的表型及基因檢測結(jié)果

3.攜帶多種基因突變患者的表型及基因檢測結(jié)果：本研究建立的易栓癥基因檢測Panel的結(jié)果顯示，共有28例患者攜帶多種基因的突變，首次發(fā)病年齡為 （32.0±13.3）歲。16例患者曾反復(fù)發(fā)生VTE，其中6例伴有獲得性血栓危險因素。在這些患者中，抗凝蛋白聯(lián)合缺陷最為常見（11/28），其中PROC合并PROS1突變的比例最高（7/28），受累患者的PS活性均顯著降低，但有5例患者的PC活性處于正常水平。其次，有3例患者同時攜帶SERPINC1和PROC突變，1例患者攜帶SERPINC1合并PROS1突變，除了SERPINC1新突變Met313Thr致病性尚不明確，其他突變均為致血栓性突變。另有10例抗凝蛋白缺陷患者攜帶合并PROCR突變，抗凝蛋白的表型檢測證實所有突變均為致病性突變，但PROCR突變（Pro145Leu和1～3號外顯子重復(fù)）的致病性仍需進一步實驗驗證。除此之外，有1例PC缺陷患者合并PLG基因1～2號外顯子雜合缺失，該突變導(dǎo)致PLG活性降至正常水平的50%。另有1例男性患者同時攜帶PROC純合突變（c.-148T>C）、F12 純合突變（Gly473Arg）和F2雜合子突變（His479Arg），PROC突變導(dǎo)致其PC活性嚴重降低，僅為正常水平的14%，凝血因子Ⅻ和Ⅱ的活性分別為15%和75%。此外，有4例患者攜帶抗凝蛋白缺陷合并THBD、TFPI或ADAMTS13等新突變，這些突變的致病性需要進一步行功能性實驗以驗證。

4.未找到基因突變的患者：本研究納入246例VTE患者中，有87例患者未找到基因突變（結(jié)果未顯示）。患者的首次發(fā)病年齡為（36.53±14.15）歲，其中，35.6%（31/87）的患者曾反復(fù)發(fā)生VTE。21例患者的VTE發(fā)生有明顯誘因，其中7例患者的狼瘡抗凝物或抗心磷脂抗體呈陽性，其他誘因包括外科手術(shù)、長期臥床或妊娠等。

表4 攜帶多種基因突變患者的表型及基因檢測結(jié)果

討 論

一、易栓癥的基因檢測適用人群

易栓癥的臨床檢測指南建議，易栓癥的遺傳性危險因素檢測應(yīng)在臨床醫(yī)師的建議下有選擇性地進行，如當患者反復(fù)發(fā)生VTE、有VTE家族史或患者年齡較小且為無明顯誘因下發(fā)生VTE才應(yīng)進行遺傳篩查；而對于有明顯誘因或僅發(fā)生單次VTE的患者，可以不進行遺傳篩查[20-21]。然而，本研究通過評估患者病史，篩選出年輕時發(fā)生VTE及反復(fù)VTE的患者進行遺傳篩查，對是否合并誘發(fā)因素及家族史沒有嚴格要求，而基因檢測結(jié)果顯示，在61例存在獲得性血栓危險因素（抗磷脂綜合征、手術(shù)或妊娠等）的患者中有40例患者攜帶遺傳性血栓危險因素，提示對存在獲得性危險因素的患者進行遺傳分析也同樣有必要的。嚴格的入組標準可以提高突變檢出率，但也會造成部分患者漏診，這應(yīng)該引起臨床醫(yī)師及檢驗人員的高度重視，并在實踐中進一步探討基因診斷的篩選標準。

二、易栓癥的測序檢測

隨著新一代測序技術(shù)的普及和測序成本的降低，部分實驗室開始采用全基因組測序或全外顯子測序進行易栓癥基因檢測，而這些測序方法會得到海量信息，對其分析的過程復(fù)雜而繁瑣。本研究的易栓癥基因檢測Panel精選了18種與中國人群VTE發(fā)生相關(guān)的基因，檢測針對性更強，準確率更高，成本更低。發(fā)現(xiàn)基因變異的患者，待其VTE急性期或治療結(jié)束后1個月后進行表型檢測，或者對其攜帶相同突變的家系成員進行表型檢測以確定基因變異的致病性。易栓癥的基因診斷結(jié)合表型診斷，為明確血栓病因提供了科學證據(jù)，也為臨床制訂個體化抗凝措施提供了理論依據(jù)，為先證者家族成員提供早期診斷和臨床前預(yù)防依據(jù)。

本研究通過易栓癥基因Panel檢測對246例VTE患者進行篩查后發(fā)現(xiàn)，有31例患者攜帶抗凝蛋白以外的基因突變，19例患者攜帶易栓癥基因的拷貝數(shù)變異，這些突變在傳統(tǒng)的血栓篩查很難被檢測出來。如有1例男性患者從25歲開始反復(fù)發(fā)生VTE，其家族史陽性，但易栓癥表型檢測及抗凝蛋白一代測序均未發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)易栓癥基因Panel檢測，發(fā)現(xiàn)其攜帶F2基因Arg596Gln突變，該突變是VTE的嚴重危險因素[18-19]。另外，有28例患者被檢出攜帶多個基因的突變，攜帶多個抗凝蛋白突變的患者一般比攜帶單個抗凝蛋白突變的患者的臨床癥狀更為嚴重，而一些患者攜帶多個突變可能減輕血栓的嚴重程度。如本研究中有1例男性患者同時攜帶PROC純合突變、F12純合突變和F2雜合子突變。通常來說，純合的PC缺陷很有可能是致命的，通常在新生兒期就會出現(xiàn)廣泛的VTE或暴發(fā)性紫癜，然而該患者的PC活性雖然僅為15%，但其在23歲才第一次發(fā)生VTE，這可能是因為F12和F2的突變導(dǎo)致凝血因子Ⅻ和Ⅱ活性降低，削弱了患者的凝血功能，從而減弱了PC活性明顯降低引起的血栓形成效應(yīng)。以上結(jié)果表明，本研究建立的易栓癥基因檢測Panel對篩選VTE患者的遺傳風險因素是靈敏且有效的，可使VTE的基因檢測更加全面。

在87例未找到基因突變的患者中，有9例患者曾發(fā)生3次及3次以上VTE，有5例患者有VTE家族史，本研究仍懷疑這些患者是否有遺傳性血栓危險因素。目前，本研究對易栓癥基因檢測Panel進行了補充，新增了17種基因，涉及纖維蛋白原異常、血管性血友病、骨髓增殖性疾病、血小板功能亢進等，將對未找到突變的患者進一步進行篩查。

總之，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院開發(fā)的易栓癥基因檢測Panel可以更加快速、準確且有效地對遺傳性血栓危險因素進行篩查。臨床可根據(jù)基因檢測結(jié)果，預(yù)判遺傳風險的大小，為患者制定相應(yīng)的預(yù)防治療方案和療程，預(yù)防血栓的發(fā)生或復(fù)發(fā)，減少血栓后綜合征的發(fā)生，值得在臨床上廣泛推廣及應(yīng)用。