千層金葉片醇提物抗氧化活性的研究

吳英詳 余雪芳 詹興堆 李欣欣 楊超 宗偉勛 李永裕

摘 ?要 ?為了探究千層金葉片醇提物的抗氧化活性，本文研究了千層金葉片醇提物及其不同極性部位的抗氧化活性和總多酚含量。研究結(jié)果表明：千層金葉片醇提物正丁醇相的總多酚含量最高，為（453.75±0.75） mg/g;75%甲醇粗提物及其正丁醇相對ABTS+自由基的清除能力較抗壞血酸（VC）強;各組分還原力強弱順序為VC>正丁醇相>75%甲醇粗提物>水相>乙酸乙酯相>BHT>石油醚相;正丁醇相和乙酸乙酯相對DPPH自由基的清除能力較醇提物和水相強，石油醚相最弱;千層金葉片醇提物及其不同極性部位清除ABTS+自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及還原力均與其總多酚含量呈正相關(guān)。除石油醚相外，千層金葉片醇提物及其不同極性部位均有較強的抗氧化活性，可作為一種良好天然抗氧化劑的物質(zhì)來源。

關(guān)鍵詞 ?千層金葉片;醇提物;總多酚;抗氧化活性

中圖分類號 ?S687.9 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?In order to explore the antioxidant activity of the methanol extract from the leaves of M. bracteata， the in vitro antioxidant activities and the total phenols of the methanol extract and its different polarity fractions were determined in this study. The n-butyl alcohol fraction showed the highest total phenols content （453.75±0.75） mg/g. The methanol extract and its n-butyl alcohol fraction had better scavenging effects than VC on ABTS+ radical. Reducing power followed the order of VC>n-butyl alcohol>methanol extract>water>ethyl acetate>BHT>petroleum ether fractions. The N-butyl alcohol and ethyl acetate fractions had better scavenging effect on DPPH radical than the methanol extract and water fractions， and the petroleum ether fraction had the weakest effect. In addition， positive correlation was existed between the total phenols content and the antioxidant activities of different polarity fractions. In addition to the petroleum ether fraction， methanol extract and its different polarity fractions showed excellent antioxidant activities， which could be used as a good natural antioxidant activity material.

Keywords ?Melaleuca bracteata leaves; alcohol extract; total polyphenol; antioxidant activity

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.017

千層金（Melaleuca bracteata），又名黃金寶樹、黃金香柳，屬桃金娘科白千層屬，為常綠小喬木或灌木。千層金適生范圍廣、生長速度快、分枝性能好且耐修剪，是一種很受歡迎的色葉喬木，不僅可用于庭園景觀、道路美化、小區(qū)綠化，還可用于林相改造，在園林上應(yīng)用越來越廣泛。除觀賞價值外，千層金還有很多藥用保健價值。人們在烹飪時常用千層金枝葉包裹食物以增香，也有人將其加工成床席作為保健用品，南非德班市當?shù)鼐用襁€將其作為一種傳統(tǒng)藥用植物，通過咀嚼其嫩葉來緩解頭痛及其他疾病[1-3]。此外，千層金葉片精油具有很強的殺螨活性和抑制蘿卜種子生長的能力[4]。

目前，國內(nèi)外對于千層金的研究報道較少，主要集中在栽培技術(shù)、組織培養(yǎng)以及精油相關(guān)方面的研究，關(guān)于其葉片醇提物抗氧化活性的研究尚未見報道。自由基對人體健康影響極大，它可損害機體的組織和細胞，引起衰老，誘發(fā)癌癥、動脈粥樣硬化等多種疾病[5-7]。凡能夠干擾自由基連鎖反應(yīng)的引發(fā)或擴散過程，抑制自由基反應(yīng)過程的任何一種物質(zhì)，均稱為自由基清除劑或抗氧化劑[8]。化學(xué)合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯（BHT）、抗壞血酸（VC）、丁基羥基茴香醚（BHA）等曾一度受到青睞，但這些人工合成化學(xué)試劑存在一定的致畸、致癌和毒性等安全性問題[9-11]。因此，研究開發(fā)安全、廣譜、高效的天然抗氧化劑成為當前研究熱點之一。本文研究了千層金葉片醇提物及其不同極性部位的總多酚含量和抗氧化活性，并分析了二者的相關(guān)性，旨在為千層金的進一步研究和開發(fā)利用提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?植物材料 ?千層金枝葉采自廣東省清遠市龍?zhí)伶?zhèn)雞心島。

1.1.2 ?主要試劑 ?DPPH（2，2-dipheny-1-picryl hy drazyl）、ABTS（2，2'-azinobis （3-ethylbenzoth ia zo li ne-6-sulfonic acid））、BHT（butylated hydroxy tolu ene）均購自美國Sigma-Aldrich公司;抗壞血酸、沒食子酸標準品、高硫酸鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、Tris、鹽酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為分析純。

1.1.3 ?主要儀器 ?紫外/可見分光光度計（U- 2900，日本Hitachi公司）、離心機（5810R，德國Eppendorf公司）、電子分析天平（BAS224S，德國Sartorius公司）、振蕩器（MS3basic，德國IKA公司）、搖床（HYG-B，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1001，日本EYELA公司）、超級智能恒溫循環(huán)器（DTY-5A，北京德天佑科技發(fā)展有限公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?千層金葉片醇提物的制備 ?將新鮮的千層金枝葉洗凈晾干，摘取葉片，凍干粉碎，過40目篩;稱取一定量的千層金葉片粉末，在溫度30?℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、甲醇體積分數(shù)為75%、料液比為1∶10條件下，用搖床震搖提取48 h后過濾，濾渣按上述條件重復(fù)提取1次，合并濾液，于40?℃下減壓濃縮至膏狀物質(zhì)，取部分冷凍干燥，得到75%甲醇粗提物（ME）的干樣，用75%甲醇配成溶液備用。

1.2.2 ?千層金葉片醇提物不同極性部位的萃取 取1.2.1中剩余的膏狀物質(zhì)，加水懸浮，搖勻后，依次分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行等體積萃取，各萃取3次，每次1 h，合并相同溶劑萃取液，分別在40?℃下減壓濃縮并冷凍干燥，得到石油醚相（PE）、乙酸乙酯相（EVE）、正丁醇相（BE）以及水相（WE），其中，PE、EVE用無水甲醇溶解，其他極性部位用75%甲醇配成溶液備用。

1.2.3 ?多酚含量的測定 ?標準曲線繪制：采用Folin-Ciocalteu法[12-13]。精密稱取干燥至恒重的沒食子酸5.0 mg，用水溶解、定容至100 mL，即為沒食子酸標準溶液。精確吸取沒食子酸標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL于棕色容量瓶中，加蒸餾水至11 mL，并以蒸餾水為對照。然后，依次加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL、75 g/L NaCO3溶液8 mL，搖勻，在室溫下避光靜置1 h，于760 nm處測定吸光值。以吸光值為縱坐標、相應(yīng)沒食子酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為：y=94.03x+0.010，R2=0.996。

樣品總多酚含量的測定：將樣液稀釋適當?shù)谋稊?shù)，按標準曲線項下方法測定吸光值。將吸光值代入標準曲線方程計算樣品中總多酚含量，結(jié)果以等量的沒食子酸表示（mg/g）。

1.2.4 ?ABTS+自由基清除能力的測定 ?參考Re等[14]的方法，略加改進。精確稱取ABTS和高硫酸鉀（K2S2O8）分別用蒸餾水溶解并混合，使其終濃度分別7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫、暗處下靜置12～16?h，即ABTS+儲備液。試驗時將ABTS+儲備液用磷酸緩沖液（10?mmol/L，pH?7.4）稀釋至OD734nm=0.700±0.020，形成ABTS+測定液。吸取不同濃度樣液50?μL，加入750?μL ABTS+測定液，充分振蕩后靜置6 min，在734 nm處測定吸光度。為確保試驗精確，需扣除樣品溶液本身的吸光度，因本試驗樣品稀釋液本身吸光度幾乎為零，可忽略。以VC為陽性對照，根據(jù)公式計算清除率及IC50值（當清除率為50%時的樣品濃度）。

清除率=[（A0A1）/A0]×100%其中，A0為ABTS+測定液加樣品溶劑的吸光值，A1為樣品吸光度。

1.2.5 ?還原力測定 ?參考Wannes等[15]的方法，往離心管中加入1 mL樣液，然后依次加入2.5 mL 濃度為0.2 mol/L PBS溶液（pH 6.6）、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min后，加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液，搖勻后離心。吸取2.5 mL上清液于試管中，依次加入2.5 mL H2O、0.5 mL 0.1%FeCl2，混勻，靜置10 min后于700 nm處測定吸光值，吸光值越高，說明還原能力越強。以VC和BHT為陽性對照，計算IC50值（當吸光度為0.5時的樣品濃度）。

1.2.6 ?DPPH自由基清除能力的測定 ?參考Mishra等[16]的方法略改進，于試管中加入1 mL不同濃度樣液和1?mL DPPH乙醇溶液（60?μmol/ L），搖勻后避光靜置30 min，以無水乙醇為空白對照，在517 nm處測定吸光度。為確保試驗精確，需扣除樣品溶液本身的吸光度，因本試驗樣品稀釋液本身吸光度幾乎為零，可忽略。以VC作為陽性對照。依據(jù)公式計算清除率及IC50值（當清除率為50%時的樣品濃度）。

清除率=[（A0A1）/A0]×100%

其中，A0表示空白對照組吸光度，A1為樣品吸光度。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行處理，采用Duncan法進行多重比較分析，顯著性差異P<0.05。試驗中每組試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示，IC50值采用回歸分析得出，相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?千層金葉片醇提物及其不同極性部位萃取得率和總多酚含量測定

由表1可以看出千層金葉片75%甲醇粗提物的得率為（22.8±0.076）%，其不同極性部位萃取物中，以BE所占比例最高，且顯著高于WE和EVE，PE最低，僅占（0.040.003）%，說明千層金葉片的醇提物絕大部分為極性物質(zhì)，而非極性物質(zhì)含量極少。由表1可知，千層金葉片各組分均含有酚類成分，且含量差異顯著（P<0.05）。其中，以BE總多酚含量最高，達（453.75±0.98） mg/g，顯著高于EVE、ME和WE，PE總多酚含量最低，僅為BE的1/15。

2.2 ?千層金葉片醇提物及其不同極性部位對ABTS+自由基的清除能力

由圖1可知，PE對ABTS+自由基的清除能力很弱，而其他極性部位以及VC均表現(xiàn)出不同程度的清除ABTS+自由基的能力，且都具有明顯的量效關(guān)系。當質(zhì)量濃度達300 μg/mL時，除了PE，其他組分的清除率均與VC相當。ME和BE對ABTS+自由基的清除能力顯著高于VC。

2.3 ?千層金葉片醇提物及其不同極性部位的還原力

千層金葉片醇提物及其不同極性部位的還原力呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，如圖2所示。在質(zhì)量濃度為150 μg/mL時，除石油醚相外，千層金葉片各組分、VC和BHT的吸光值均超過0.5;當濃度達

2.4 ?千層金葉片醇提物及其不同極性部位對DPPH自由基的清除能力

千層金葉片醇提物及其不同極性部位對DPPH自由基均具有不同程度的清除能力，當質(zhì)量濃度小于20 μg/mL時，各組分對DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的升高而急劇增大，量效關(guān)系明顯，如圖3所示。PE清除能力最弱，當濃度達到20?μg/mL時，PE對DPPH自由基的清除率達80%以上，其他組分和VC均達到90%以上，且沒有明顯差異，濃度繼續(xù)增加時清除率升高緩慢。

2.5 ?千層金葉片抗氧化活性與總多酚含量的相關(guān)性分析

千層金葉片醇提物及其不同極性部位抗氧化活性的IC50值見表2，結(jié)果表明，千層金葉片醇提物及其不同極性部位以及VC對ABTS+自由基的清除能力大小依次為ME>BE>VC>WE>EVE>PE;除石油醚相外，千層金葉片其他組分的IC50值均顯著低于BHT，具有較強的還原力，其強弱次序為VC>BE>ME>WWE>EVE>BHT>PE;千層金葉片各組分和VC對DPPH自由基清除能力的強弱次序為VC>BE≥EVE>ME>WE>PE，其中，EVE的IC50值與BE無顯著差異（P<0.05），二者對DPPH自由基的清除能力相當。

分析千層金葉片醇提物及其不同極性部位抗氧化活性的IC50值與其總多酚含量相關(guān)性的結(jié)果表明，千層金葉片醇提物及其不同極性部位的ABTS+自由基清除能力、還原力和DPPH自由基清除能力的IC50值與其總多酚含量之間均存在顯著的線性相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R2分別為0.930、0.932和0.930），說明千層金葉片各組分的抗氧化活性與各自的總多酚含量呈顯著的正相關(guān)。

3 ?討論

本研究結(jié)果表明，千層金葉片醇提物及其不同極性部位均含有多酚類物質(zhì)，其含量在29.30～ 453.75?mg/g之間，說明千層金葉片中的酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從非極性到極性部位均有分布，其中，以中等極性部位的酚類成分含量最高，即正丁醇相和乙酸乙酯相中的多酚類物質(zhì)含量最高，而非極性部位酚類物質(zhì)含量很少。沈勇根等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與千層金同科植物丁香的非揮發(fā)性成分中，總多酚的含量隨溶劑極性增大而降低;但劉騫等[18]的研究表明，溶劑極性越大，丁香提取物中總多酚含量越大。本研究表明，千層金葉片各組分總多酚含量大小依次為正丁醇相>乙酸乙酯相>75%甲醇粗提物>水相>石油醚相，其含量與溶劑極性無關(guān)。

千層金葉片醇提物及其不同極性部位的還原力和對ABTS+自由基、DPPH自由基的清除能力均呈明顯量效關(guān)系，且在一定的濃度范圍內(nèi)清除率和還原力都急劇上升，當達到較大的濃度后，抗氧化效果升高緩慢。這可能是由于千層金葉片醇提物中含有某些兼有抗氧化和促氧化效果的物質(zhì)，這類物質(zhì)在低劑量時具有抗氧化效果，但在高劑量條件下反而具有促進氧化的效果，這樣有時反而可以對細胞起到一定的保護作用，如黃酮類化合物[19]。

千層金葉片醇提物及其不同極性部位總多酚含量與清除ABTS+自由基能力、DPPH自由基能力及還原力呈顯著正相關(guān)，總多酚含量越高，其抗氧化活性愈強。由此推測酚類物質(zhì)是千層金葉片醇提物抗氧化活性的主要作用成分。

在ABTS+自由基的清除能力測定試驗中，千層金葉片75%甲醇粗提物表現(xiàn)出很突出的清除效果，顯著高于其他極性部位。粗提物中含有所有極性部位所含有的物質(zhì)，這些物質(zhì)可能會在一定的抗氧化體系中產(chǎn)生協(xié)同作用，使得其抗氧化活性高于其他極性部位。有些化合物在單獨存在的狀態(tài)下只有微弱的活性，但當加入一些即使本身沒有抗氧化活性的物質(zhì)后，其抗氧化活性會大大增加。如麥苗中阿魏酸、抗壞血酸和總黃酮之間具有協(xié)同抗氧化作用[20];荔枝皮原花青素和VC、VE均有協(xié)同作用，且與VC的協(xié)同作用強于VE[21]。

千層金葉片醇提物的石油醚相對ABTS+自由基的清除能力和還原力都很弱，但對DPPH自由基卻表現(xiàn)出較強的清除能力。周中流等[22]對卷丹醇提物及其不同極性部位的抗氧化活性進行了研究，其中，石油醚相對DPPH具有較好的清除能力，但對ABT+自由基的清除能力卻很弱。祝連彩等[23]對仙鶴草醇提物的研究表明，其石油醚相對DPPH自由基和超氧自由基具有很好清除效果，但對羥自由基的清除能力卻很弱。這可能與提取物石油醚相中的物質(zhì)在不同抗氧化體系中的氧化條件、步驟或局部反應(yīng)不同有關(guān)。

目前，千層金活性物質(zhì)的研究多局限于精油領(lǐng)域[24]，千層金葉片醇提物抗氧化活性的研究還未見報道。本文對千層金葉片醇提物及其不同極性部位的抗氧化活性研究結(jié)果表明，千層金葉片75%甲醇粗提物及其乙酸乙酯相、正丁醇相和水相在3個抗氧化體系中均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，有望成為優(yōu)良的植物抗氧化劑而應(yīng)用于食品、醫(yī)療保健、化妝品和日化工業(yè)等許多領(lǐng)域。尤其是正丁醇相，應(yīng)對其進行進一步的分離純化，明確其抗氧化作用的主成分，探索其作用機理，并進行活體試驗，以獲得安全高效的天然抗氧化劑。此外，千層金葉片中含有較豐富的多酚類物質(zhì)，關(guān)于其含量、成分及活性尚未見報道，今后可對其進行進一步的研究開發(fā)。

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