白樺脂酸通過阻斷Fas-Fasl信號通路抑制異氟醚誘導的大鼠腦神經(jīng)元損傷

壽瓊華,解雅英

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科,呼和浩特 010050;*通訊作者,E-mail:qionghua-shou66@126.com)

異氟醚具有麻醉誘導快、無刺激、蘇醒迅速等特點[1,2]。但是近年來越來越多的學者認為異氟醚具有一定的神經(jīng)毒性,尤其是對小兒神經(jīng)發(fā)育有較大的影響。研究表明,異氟醚可誘導幼鼠細胞凋亡、神經(jīng)發(fā)育阻滯,并造成一定程度的學習記憶功能障礙[3,4]。白樺脂酸(betulinic acid,BA)是一種五環(huán)三萜酸,主要從白樺樹皮中提取[5]。研究表明,BA具有諸多生物活性,具有一定的抗腫瘤作用[6,7],另外白樺脂酸可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Caspase3來抑制藥物引起的急性肝損傷,因此我們推測白樺脂酸可以抑制異氟烷誘導的腦神經(jīng)元的凋亡。因此,本實驗以大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象,研究白樺脂酸對異氟醚誘導的發(fā)育期大鼠腦神經(jīng)元細胞的影響,并探討其通過阻斷Fas-Fasl信號通路抑制神經(jīng)元損傷的干預機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SPF級SD大鼠,購自于北京維通利華有限責任公司(許可證號SYXK(京)2017-0022),雌雄各半,于25 ℃ SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

10%胎牛血清(上海碧云天公司);線粒體熒光染料(上海碧云天公司);高速低溫離心機(北京時代北利離心機有限公司);青霉素(上海碧云天公司);鏈霉素(上海碧云天公司);異氟醚(濟南晟齊醫(yī)藥科技有限公司);白樺脂酸(上海純優(yōu)生物科技有限公司);KGA107凱基細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司);NovoCyte流式細胞儀(艾森生物(杭州)有限公司);RTCA實時細胞分析系統(tǒng)(艾森生物(杭州)有限公司);美國伯樂PCR儀(美國Bio-rad公司)。

1.3 海馬組織神經(jīng)元分離培養(yǎng)

大鼠用水合氯醛麻醉后斷頸處死后取海馬組織,剪碎海馬組織,加入胰蛋白酶(1.5 g/L)于37 ℃、CO2的培養(yǎng)箱中消化25 min,加入含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基。1 500 r/min離心5 min并用PBS洗滌,重復3次。調(diào)整海馬細胞水平并接種于9孔培養(yǎng)板,加入阿糖胞苷10 mg以抑制神經(jīng)細胞的增殖。將海馬神經(jīng)元細胞于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、10 mmol/L的HEPES緩沖液及100 U/ml的青霉素和鏈霉素)培養(yǎng),于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境傳代培養(yǎng),2-3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.4 動物分組及模型制備

將海馬神經(jīng)元細胞隨機分為對照組、異氟醚誘導組、白樺脂酸低劑量組(0.001 mol/L)、白樺脂酸中劑量組(0.005 mol/L)、白樺脂酸高劑量組(0.01 mol/L)。異氟醚誘導組細胞于2.4%異氟醚環(huán)境中暴露2 h,白樺脂酸給藥組分別給藥培養(yǎng)后置于2.4%異氟醚環(huán)境中暴露2 h,對照組于正常環(huán)境中培養(yǎng)。

1.5 流式細胞儀檢測腦神經(jīng)元細胞凋亡

將處于對數(shù)生長期的大鼠腦神經(jīng)元細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板,1×104個細胞/孔。實驗設計4個組別(對照組、白樺脂酸低劑量組、白樺脂酸中劑量組、白樺脂酸高劑量組),每組3個平行孔。胰蛋白酶消化并收集細胞。按照KGA107凱基細胞凋亡檢測試劑盒說明書,用PBS清洗各孔,1 500 r/min離心5 min,去上清,用預冷的PBS重懸。反復操作3次,凋亡抗體染色后,37 ℃避光孵育20 min，隨后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 PCR法檢測Fas、Fasl及caspase-8基因

采用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測Fas、Fasl及caspase-8 mRNA表達水平。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min，93 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸40 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸60 s。取10 μl擴增產(chǎn)物和6 μl的Maker同時上樣，瓊脂糖凝膠電泳分離(120 V 40 min)，銀染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析擴增結果。Fas、Fasl及caspase-8的引物序列見表1。

表1 Fas、Fasl及caspase-8的引物序列

Table 1 Primer sequences of Fas, Fasl and caspase-8

基因上游引物上游引物Fas5′-CGATT CTGAG ATGGT GAA-3′5′-TGGT TCTTG TCTGT GTAAT-3′Fasl5′-TGTCT CCTTG TGATG TTC-3′5′-GATGA TTCTG TATCGC CTTTG-3′caspase-85′-GAT GAG GCA GAC TTT CT G CT-3′5'-CAT AGT TCA CGC CAG TCA GGA T-3′

1.7 Western blot分析cyt c、BID、caspase-9、Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表達水平

SDS-PAGE電泳凝膠并置于電泳槽上,將細胞cyt c、BID、caspase-9、Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白上樣并電泳。電泳后轉印到PVDF膜上,封閉并用TBST清洗后分別加入稀釋過的蛋白抗體(cyt c 1 ∶400、BID 1 ∶400、caspase-9 1 ∶400、Bcl-2 1 ∶400、Bax 1 ∶400、caspase-3 1 ∶400 PARP 1 ∶400),4 ℃過夜，TBST清洗4次(每次5 min)；隨后加入HRP標記的二抗(稀釋比例1 ∶400)，37 ℃孵育2 h，TBST洗4次×5 min。設立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗(稀釋比例1 ∶400)，HRP標記的IgG為二抗。

1.8 線粒體膜電位(MTP)的測定

將分離提取的線粒體于1 000 r/min離心5 min,棄上清,用新的培養(yǎng)基重懸細胞;加入15 nmol/L的活細胞線粒體的熒光染料,37 ℃孵育35 min，1 000 r/min離心5 min,PBS沖洗3次。取細胞懸液1 ml,用流式細胞儀分析并繪制線粒體膜電位的熒光值分布圖,以熒光強度表示線粒體膜電位變化,即熒光強度越高則線粒體膜電位越高。流式細胞儀激發(fā)光波長488 nm,發(fā)射光波長530 nm。

1.9 線粒體呼吸功能的測定

氧電極法測定線粒體的呼吸功能。定標氧電極,在反應杯中分別加入200 mmol/L的蔗糖、15 mmol/L的Tris、15 mmol/L的EGTA、15 mmol/L的磷酸二氫鉀1 ml,并加入0.5 ml線粒體懸液。待溶氧曲線穩(wěn)定后,加入10 mmol/L的琥珀酸鈉;再次等待曲線穩(wěn)定,加入0.05 mmol/L的ADP。計算Ⅲ態(tài)呼吸曲線斜率和Ⅳ態(tài)呼吸曲線斜率，并以兩者比值數(shù)值越大表示線粒體呼吸功能越強。

1.10 神經(jīng)元細胞ATP含量檢測

將神經(jīng)元細胞接種于12孔培養(yǎng)板,按照ATP含量測定試劑盒說明書進行操作,并利用紫外分光光度計測量各孔450 nm吸光度值,按以下公式計算細胞內(nèi)ATP含量。ATP含量=[(測定OD值-對照OD值)/(標準-空白)]×標準樣濃度(1×103μmol/L)×樣本測試前稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 白樺脂酸抑制了異氟醚誘導的腦神經(jīng)元細胞凋亡

異氟醚誘導組細胞凋亡率(早期、晚期凋亡率之和)高于對照組及給藥組的細胞凋亡率;且隨著白樺脂酸給藥量劑量的增加,細胞凋亡比例逐漸降低。異氟醚誘導組與低劑量、中劑量白樺脂酸給藥組細胞凋亡比例明顯高于對照組,高劑量白樺脂酸給藥組細胞凋亡比例明顯低于異氟醚誘導組(P<0.05),但與對照組相比,差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表2)。

表2 不同處理后大鼠腦神經(jīng)元細胞凋亡率(%)

Table 2 Rate of cell apoptosis of rat brain neuron after different treatment(%)

分組早期凋亡率晚期凋亡率凋亡率對照組3.72±0.521.25±0.494.85±0.86異氟醚誘導組23.13±4.69?12.49±2.21?35.56±5.25?白樺脂酸低劑量組18.75±2.25?#6.88±1.26?#25.66±3.98?#白樺脂酸中劑量組12.28±2.55?#4.10±0.86?#16.39±3.25?#白樺脂酸高劑量組9.55±1.86?#2.91±0.35?#12.50±2.27?# F12.37511.45214.815 P0.0210.0160.025

與對照組比較,*P<0.05;與異氟醚誘導組比較,#P<0.05

2.2 白樺脂酸對異氟醚誘導Fas、Fasl及caspase-8基因轉錄水平的影響

與對照組相比,異氟醚誘導后,大鼠腦神經(jīng)元細胞Fas、Fasl及caspase-8 mRNA表達水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白樺脂酸各給藥組與異氟醚誘導組相比,均下調(diào)Fas、Fasl及caspase-8表達;且隨著給藥劑量的增加,Fas、Fasl及caspase-8基因轉錄水平逐漸降低,呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1、表3)。

2.3 白樺脂酸對異氟醚誘導cyt c、BID及caspase-9蛋白表達水平的影響

與對照組相比,異氟醚誘導后,大鼠腦神經(jīng)元細胞cyt c、BID及caspase-9表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白樺脂酸各給藥組與異氟醚誘導組相比,cyt c、BID及caspase-9表達均下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2、表4)。隨著給藥量的增加,cyt c、BID及caspase-9蛋白表達水平逐漸降低,以高劑量組效果最為明顯。

圖1 RT-PCR檢測不同處理后Fas、Fasl及caspase-8基因表達Figure 1 Expression of Fas,Fasl and caspase-8 after different treatment by RT-PCR

表3 白樺脂酸對異氟醚誘導Fas、Fasl及caspase-8基因轉錄水平的影響

Table 3 Effects of betulinic acid on isoflurane-induced Fas, Fasl and caspase-8 gene expression

組別FasFaslcaspase-8對照組1.06±0.061.02±0.051.08±0.09異氟醚誘導組4.45±0.21?4.49±0.54?5.23±0.20?白樺脂酸低劑量組2.81±0.25?#2.85±0.22?#3.81±0.29?#白樺脂酸中劑量組2.43±0.22?#2.53±0.22?#3.23±0.21?#白樺脂酸高劑量組2.02±0.20?#2.15±0.24?#2.82±0.23?# F10.3619.58710.209 P0.0190.0230.017

與對照組比較,*P<0.05;與異氟醚誘導組比較,#P<0.05

圖2 Western blot檢測cyt c、BID、caspase-9蛋白表達情況Figure 2 Expression of cyt c, BID and caspase-9 protein by Western blot

表4 白樺脂酸對異氟醚誘導cyt c、BID及caspase-9蛋白表達水平的影響

Table 4 Effects of betulinic acid on the expression of cyt c, BID and caspase-9 induced by isoflurane

指標cytcBIDcaspase-9對照組1.06±0.061.10±0.081.38±0.04異氟醚誘導組4.23±0.21?4.79±0.52?5.03±0.22?白樺脂酸低劑量組2.74±0.20?#2.95±0.18?#3.74±0.21?#白樺脂酸中劑量組2.20±0.27?#2.24±0.22?#3.18±0.19?#白樺脂酸高劑量組1.98±0.17?#1.95±0.23?#2.62±0.23?# F8.37511.7629.235 P0.0410.0210.026

與對照組比較,*P<0.05;與異氟醚誘導組比較,#P<0.05

2.4 白樺脂酸對異氟醚誘導Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表達水平的影響

與對照組相比,異氟醚誘導后,大鼠腦神經(jīng)元細胞Bax、caspase-3及PARP蛋白表達水平顯著升高,Bcl-2表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白樺脂酸各給藥組均能抑制Bax、caspase-3及PARP蛋白的表達,上調(diào)Bcl-2的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3,表5)。四者都以高劑量給藥組作用效果最為明顯,其次是中劑量給藥組。

圖3 Western blot檢測Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表達情況Figure 3 Expression of Bcl-2, Bax, caspase-3 and PARP by Western blot

2.5 白樺脂酸對異氟醚誘導線粒體膜電位和呼吸功能的影響

與對照組相比,異氟醚誘導后,線粒體膜電位(以熒光強度表示)和呼吸功能顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與異氟醚誘導組相比,白樺脂酸各給藥組線粒體膜電位水平增高,呼吸功能改善,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表6)。線粒體膜電位和呼吸功能與白樺脂酸給藥劑量呈正相關,高劑量組效果最明顯。

2.6 白樺脂酸對異氟醚誘導神經(jīng)元內(nèi)ATP含量的影響

與對照組相比,異氟醚誘導后,神經(jīng)元內(nèi)ATP含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白樺脂酸各給藥組與異氟醚誘導組相比,ATP含量均有不同程度的升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表7)。其中高劑量給藥組升高效果最明顯,ATP含量達到(486.51±13.30)μmol/L,中劑量組次之。

表5 白樺脂酸對異氟醚誘導Bcl-2、Bax、caspase-3及PARP蛋白表達水平的影響

Table 5 Effects of betulinic acid on the expression of Bcl-2, Bax, caspase-3 and PARP induced by isoflurane

組別Bcl-2Baxcaspase-3PARP對照組1.18±0.051.02±0.051.49±0.041.09±0.06異氟醚誘導組0.43±0.06?5.15±0.70?5.42±0.53?5.83±0.51?白樺脂酸低劑量組0.62±0.09?#4.09±0.55?#3.57±0.81?#4.45±0.50?#白樺脂酸中劑量組0.91±0.04?#3.41±0.23?#3.18±0.40?#3.89±0.32?#白樺脂酸高劑量組1.05±0.05?#2.15±0.10?#2.81±0.34?#2.88±0.20?# F9.28212.30510.1729.6215 P0.0160.0030.0050.009

與對照組比較,*P<0.05;與異氟醚誘導組比較,#P<0.05

表6 白樺脂酸對異氟醚誘導線粒體膜電位和呼吸功能的影響

Table 6 Effects of betulinic acid on mitochondrial membrane potential and respiratory function induced by isoflurane

組別熒光強度呼吸速率(%)對照組7.20±0.474.72±0.32異氟醚誘導組4.40±0.38?1.49±0.03?白樺脂酸低劑量組5.01±0.57?#2.05±0.05?#白樺脂酸中劑量組5.67±0.43?#2.73±0.22?#白樺脂酸低高量組6.52±0.30?#4.15±0.24?# F11.24113.815 P0.0260.015

與對照組比較,*P<0.05;與異氟醚誘導組比較,#P<0.05

表7 白樺脂酸對異氟醚誘導神經(jīng)元內(nèi)ATP含量的影響

Table 7 Effects of betulinic acid on the content of ATP in isoflurane-induced neurons

組別ATP含量(μmol/L)對照組547.20±13.42異氟醚誘導組134.22±16.36?白樺脂酸低劑量組405.21±12.53?#白樺脂酸中劑量組445.07±14.42?#白樺脂酸低高量組486.51±13.30?# F15.245 P0.011

與對照組比較,*P<0.05;與異氟醚誘導組比較,#P<0.05

3 討論

近年來異氟醚對神經(jīng)系統(tǒng)的毒害作用引起廣泛關注[8,9]。研究表明,異氟醚可引起神經(jīng)發(fā)育敏感期的組織發(fā)生病理學損傷性改變,誘導海馬組織細胞凋亡[10,11]。研究同時證實,Fas、FasL蛋白的表達與細胞凋亡程度呈正相關,Fas/FasL信號通路參與了腦神經(jīng)元細胞凋亡過程[12]。

Fas是位于人10號染色體q24.1區(qū)的跨膜糖蛋白[13],FasL作為Fas在體內(nèi)的天然配體,兩者結合后可啟動細胞凋亡程序,激活下游信號蛋白,促使神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡。caspase-3、8、9作為caspase家族的重要成員,是Fas介導凋亡信號下游的關鍵性效應蛋白酶,尤其是caspase-3,其在細胞質中的高表達預示著細胞發(fā)生不可逆轉的凋亡[14]。

cyt c是線粒體介導細胞凋亡的重要因子,當細胞受到凋亡刺激時,它的表達量會上調(diào)并激活caspase級聯(lián)反應促使神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡[15,16]。而Bcl-2可通過阻礙cyt c的釋放,阻斷caspase蛋白酶的激活,最終抑制細胞凋亡[17]。此外,Bax、BID、PARP的高表達亦可引起神經(jīng)元細胞的凋亡[18]。白樺脂酸可通過激活Fas/FasL通路調(diào)節(jié)凋亡相關基因、蛋白的表達,從而達到抗癌、抗HIV、抗炎等目的[19-21]。但是關于其對腦神經(jīng)元細胞凋亡影響及作用機制的研究較少,因此探究白樺脂酸對海馬體神經(jīng)元細胞的凋亡影響及可能的作用機制對于腦損傷的治療具有重要的意義。

本研究采用異氟醚誘導發(fā)育期大鼠腦神經(jīng)元損傷,流式細胞檢測結果表明不同濃度的白樺脂酸均能夠顯著降低細胞凋亡比例;線粒體是哺乳動物細胞內(nèi)的重要細胞器,是呼吸鏈電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的主要場所。線粒體膜電位是線粒體發(fā)揮生物學功能的重要基礎。線粒體膜電位的破壞,對于細胞凋亡具有重要影響。本研究通過氧電極和紫外分光光度檢測表明各白樺脂酸給藥組均能提高大鼠線粒體呼吸水平和細胞內(nèi)ATP含量。進而提示白樺脂酸對于維持線粒體穩(wěn)定以及抑制神經(jīng)元凋亡具有重要作用。本研究表明,一定濃度的白樺脂酸能夠下調(diào)凋亡相關蛋白Fas、Fasl、caspase-8、cyt c、BID、caspase-9、Bax、caspase-3、PARP的表達,并上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達。該結果說明了Fas/FasL通過內(nèi)源和外源兩條通路引起大鼠神經(jīng)元細胞凋亡,白樺脂酸可通過調(diào)節(jié)Fas/FasL信號通路相關基因以及蛋白的表達,從而達到抑制異氟醚對大鼠腦神經(jīng)元細胞誘導的損傷,起到保護大腦腦神經(jīng)元的目的。

綜上所述,白樺脂酸抑制異氟烷誘導的腦神經(jīng)元損傷的機制是通過下調(diào)凋亡相關蛋白Fas、Fasl、caspase-8、cyt c、BID、caspase-9、Bax、caspase-3、PARP的表達,上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達,激活Fas/FasL信號通路最終引起細胞凋亡。但是其具體的作用機制還需要進一步的探討。