汾遠(yuǎn)2號遠(yuǎn)志的rDNA ITS等位基因特異性PCR鑒別研究

李 娟,王丹丹,孔冉冉,田洪嶺,張福生,秦雪梅,馬存根

(1山西藥科職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系,太原 030031;2山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心;3石家莊四藥有限公司;4山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;5山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所;6山西中醫(yī)藥大學(xué);*通訊作者,E-mail:ample1007@163.com;#共同通訊作者,E-mail:macungen2001@163.com)

遠(yuǎn)志是我國重要的大宗中藥材之一[1],中國藥典規(guī)定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵葉遠(yuǎn)志(PolygalasibiricaL.)的干燥根,具有安神益智、交通心腎、祛痰消腫等功效,是臨床益智類處方中使用頻率名列前3位的單味中草藥[2-5],其臨床需求量正日益增大。目前,市場上常見的遠(yuǎn)志偽品有:白薇(CynanchumatratumBge.)、蔓生白薇(C.versicolorBge.)[6]、麥冬[Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl.][7]等,上述偽品給遠(yuǎn)志藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性與用藥安全性造成了極大的隱患。晉遠(yuǎn)1號(簡稱JY1)是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所(簡稱汾陽經(jīng)作所)選育的我國第一個(gè)遠(yuǎn)志品種[8];而汾遠(yuǎn)2號(簡稱FY2)則是汾陽經(jīng)作所選育出來的另一個(gè)遠(yuǎn)志新品種,并于2015年11月通過了田間認(rèn)定。本課題組之前的研究曾發(fā)現(xiàn)JY1和FY2在化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)上各具優(yōu)勢[9],上述遠(yuǎn)志新品種的成功選育,為今后擴(kuò)大遠(yuǎn)志藥材的用藥資源奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

rDNA中的ITS序列具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特點(diǎn)。近年來,ITS序列在藥用植物的分子鑒定(種間、種內(nèi)的真?zhèn)舞b別研究)、遺傳多樣性、親緣關(guān)系鑒別等方面已有大量研究[10,11]。樊杰等[12]利用ITS 1和ITS 2序列鑒別出遠(yuǎn)志屬7種藥用植物,馬孝熙等[13]利用psbA-trnH序列對中藥材遠(yuǎn)志及其混偽品進(jìn)行了分子鑒定,而依據(jù)rDNA ITS序列堿基差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性PCR鑒別引物,用于遠(yuǎn)志種間尤其是遠(yuǎn)志種內(nèi)的研究則尚未見報(bào)道。本研究通過測定rDNA ITS序列,針對FY2的rDNA ITS序列堿基差異位點(diǎn),設(shè)計(jì)特異性PCR鑒別引物,從而實(shí)現(xiàn)FY2的分子鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物材料 本次實(shí)驗(yàn)用到的卵葉遠(yuǎn)志(P.sibirica),采自于陜西省寶雞市太白縣桃川鎮(zhèn)(野生);而遠(yuǎn)志(P.tenuifolia)樣本則均來源于山西省,分為:同一產(chǎn)地(汾陽經(jīng)作所,栽培,不同農(nóng)藝性狀,No.2-No.21)和不同產(chǎn)地(栽培和野生,No.22-No.29)的兩類樣本。樣品信息見表1。樣品經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心張福生副教授鑒定為正品,并存放于山西大學(xué)標(biāo)本室。

1.1.2 儀器與試劑 基因擴(kuò)增儀(TC-XP-D,杭州博日科技有限公司),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-6B,北京市六一儀器廠),全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(ZF-258,上海嘉鵬科技有限公司),高速臺式冷凍離心機(jī)(TGL-16,湘儀離心機(jī)),移液器(Eppendorf)。

Biowest瓊脂糖,β-巰基乙醇均購于太原灝洋生物科技有限公司;GoldView I型核酸染色劑,北京索萊寶科技有限公司;DL 2000 DNA Marker,日本TaKaRa公司;CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(貨號:DN14,50次),北京艾德萊生物科技有限公司;基因組DNA擴(kuò)增反應(yīng)液(2×EasyTaqPCR SuperMix),北京全式金生物技術(shù)有限公司;三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇等試劑,國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和ITS測序 用十六烷基三甲基溴化銨法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)植物基因組DNA快速提取試劑盒提取所有樣本的DNA,并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。以JY1和FY2的DNA為模板,通用型引物(5F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;4R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)作為PCR引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25 μl,含有:3 μl模板DNA;引物5F與4R,各1 μl;12.5 μl 2×EasyTaqPCR SuperMix;7.5 μl ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?93 ℃ 5 min;93 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min,10 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。如果在600 bp左右出現(xiàn)一條明亮的條帶,則說明PCR反應(yīng)成功,并將PCR產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司測序。為保證序列的可靠性及真實(shí)性,所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測序。

表1 遠(yuǎn)志樣品信息表

Table 1 Samples information of Polygalae Radix

編號樣品 采集地 生長方式1卵葉遠(yuǎn)志 P. sibirica L.陜西省寶雞市太白縣桃川鎮(zhèn)野生2遠(yuǎn)志 P. tenuifolia(JY1)汾陽經(jīng)作所栽培3遠(yuǎn)志 P. tenuifolia(FY2)汾陽經(jīng)作所栽培4遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培5遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培6遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培7遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培8遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培9遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培10遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培11遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培12遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培13遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培14遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培15遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培16遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培17遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培18遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培19遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培20遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培21遠(yuǎn)志 P. tenuifolia汾陽經(jīng)作所栽培22遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省臨汾市襄汾縣南賈鎮(zhèn)南賈村栽培23遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省呂梁市石樓縣小蒜村野生24遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省運(yùn)城市聞喜縣凹底鎮(zhèn)辛村栽培25遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省運(yùn)城市夏縣廟前鎮(zhèn)中條山產(chǎn)地栽培26遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省忻州市定襄縣受祿鄉(xiāng)上零山村野生27遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省忻州市河曲縣巡鎮(zhèn)野生28遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省忻州市靜樂縣城朝陽山野生29遠(yuǎn)志 P. tenuifolia山西省陽泉市盂縣西潘鄉(xiāng)鄭溝村野生

1.2.2 測序結(jié)果分析與特異性引物設(shè)計(jì) 測序所得序列,用生物學(xué)軟件DNAStar version 4.0校對拼接,去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。測序所得的序列采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站在線BLAST程序進(jìn)行序列同源性檢索,結(jié)果表明JY1、FY2與NCBI中遠(yuǎn)志的相似度最高(相似度達(dá)99.36%),證實(shí)測序結(jié)果具有很好的可靠性。利用DNAMAN對比上述所有樣品的序列,找出FY2所不同于其他遠(yuǎn)志序列的差異位點(diǎn),并用FY2的序列和NCBI中已有的遠(yuǎn)志序列(NCBI登錄號分別為:KM051449.1、AB507258.1、DQ267099.1)和作者測序得到的卵葉遠(yuǎn)志的序列(NCBI登記號為:1885126)進(jìn)行比對,驗(yàn)證差異位點(diǎn)的正確性。FY2和JY1、卵葉遠(yuǎn)志以及NCBI網(wǎng)上遠(yuǎn)志序列的比對結(jié)果見圖1。FY2在第123位點(diǎn)為T,其余樣品均為A,第553位點(diǎn)為T,其余樣品均為C,共有兩個(gè)差異位點(diǎn)。根據(jù)FY2差異位點(diǎn)的位置,利用生物學(xué)軟件Primer premier 5.0分別在ITS序列的上、下游各設(shè)計(jì)約20個(gè)堿基的引物[14-15],最終確定FY2的4對特異性PCR引物,見表2。

1.2.3 特異性PCR引物鑒別 以不同的遠(yuǎn)志樣本DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系與1.2.1的PCR擴(kuò)增體系相同,1-3號引物的PCR擴(kuò)增條件與1.2.1項(xiàng)下的PCR擴(kuò)增條件相同,4號引物的退火溫度為65 ℃,其余條件均同于1.2.1項(xiàng)下的PCR擴(kuò)增條件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察,并照相保存。為了檢測特異性PCR引物鑒定方法的適用性和靈敏度,將遠(yuǎn)志基因組DNA模板分別進(jìn)行等量混合和梯度稀釋后,按照上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖1 FY2與JY1、卵葉遠(yuǎn)志以及NCBI網(wǎng)上序列的比對結(jié)果Figure 1 The sequence comparison result of the FY2, JY1, P. sibirica and NCBI

表2 FY2的特異性PCR引物

Table 2 Allele-specific identified primer pairs for FY2

引物編號引物序列(5′-3′) 退火溫度(℃)1F1:CGACCGTTGGACACGTATTR1:TCGCCCCAAGAGATGTGA602F2:CGACCGTTGGACACGTATTR2:TCGCCCCAAGAGATCAGA603F3:CGACCGTTGGACACGAATTR3:TCGCCCCAAGAGATGTGA604F4:CGACCGTTGGACACGTATTR4:TCGCCCCAAGAGATGAGA65

2 結(jié)果

2.1 特異性PCR引物的適用性考察

2.1.1 特異性PCR引物的種間適用性考察 以卵葉遠(yuǎn)志P.sibirica作為DNA模板,用4對引物分別擴(kuò)增卵葉遠(yuǎn)志;并以1號引物對為例,設(shè)置陰性對照組,分別驗(yàn)證4對引物的特異性,其結(jié)果見圖2。4對引物不能擴(kuò)增出卵葉遠(yuǎn)志,說明這4對引物能夠鑒別出卵葉遠(yuǎn)志,具有種間特異性;陰性對照組中沒有加入DNA模板,所以沒有任何條帶出現(xiàn)。

2.1.2 特異性PCR引物的種內(nèi)適用性考察 經(jīng)研究表明,地理位置相近的遠(yuǎn)志資源相似性系數(shù)較高,親緣關(guān)系較近[16],為驗(yàn)證上述4對引物的廣泛適用性,首先取采自于汾陽經(jīng)作所的JY1和FY2的DNA,運(yùn)用表2中的4對特異性引物分別對相應(yīng)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。圖3結(jié)果顯示,4對特異性引物只能擴(kuò)增FY2,不能擴(kuò)增JY1,表明4對特異性引物只對FY2適用,專屬性較好。

1-4.4對引物分別擴(kuò)增卵葉遠(yuǎn)志;K.陰性對照;M.DL 2000 DNA Marker圖2 特異性引物對卵葉遠(yuǎn)志的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR amplification results of specific primers on P. sibirica

1,3,5,7.DNA模板為JY1;2,4,6,8.DNA模板為FY2;1,2.擴(kuò)增引物為引物對1;3,4.擴(kuò)增引物為引物對2;5,6.擴(kuò)增引物為引物對3;7,8.擴(kuò)增引物為引物對4;M.DL 2000 DNA Marker圖3 特異性引物對JY1和FY2的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 PCR amplification results of specific primers on JY1 and FY2

將表1中遠(yuǎn)志基因組DNA等量混勻后進(jìn)行PCR,結(jié)果見圖4。圖3B中1-4泳道中沒有FY2的基因組DNA,結(jié)果沒有擴(kuò)增條帶出現(xiàn);而圖4A中的DNA模板為含有FY2 DNA的等量混合物,結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物在463 bp處有單一的條帶,FY2在多種遠(yuǎn)志的混合材料中被很好地鑒別出來。經(jīng)過重復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果保持穩(wěn)定。

2.2 特異性引物的靈敏度考察

檢測FY2的DNA濃度為11.8 ng/μl。將上述DNA樣品進(jìn)行梯度稀釋,稀釋后的濃度分別為1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1-4.4對引物分別擴(kuò)增含有FY2 DNA的等量混合樣品;5-8.4對引物分別擴(kuò)增沒有FY2 DNA的等量混合樣品;M.DL 2000 DNA Marker圖4 特異性引物對混合樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 4 PCR amplification results of specific primers on mixed samples

分別以上述稀釋的DNA樣品為模板,用1-4號引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系、PCR擴(kuò)增程序和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法同上,結(jié)果見圖5。當(dāng)FY2的DNA模板濃度稀釋至0.011 8 ng/μl時(shí),即用量為0.059 ng時(shí),1號引物對在約463 bp處依然出現(xiàn)FY2的特異性條帶。因此,1號引物對的檢測靈敏度可達(dá)0.011 8 ng/μl,可見,本方法的檢測靈敏度高,可檢測出樣品中約0.059 ng的FY2。同理,2號引物對可檢測出樣品中約0.118 ng的FY2;3號引物對可檢測出樣品中約0.118 ng的FY2;4號引物對可檢測出樣品中約0.059 ng的FY2。經(jīng)過多次重復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果保持穩(wěn)定。

1-5.DNA濃度分別為1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物為1號引物;M.DL 2000 DNA Marker;6-10.DNA濃度分別為1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物為2號引物;11-15.DNA濃度分別為1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物為3號引物;16-20.DNA濃度分別為1.18,0.236,0.118,0.023 6,0.011 8 ng/μl,引物為4號引物圖5 特異性引物對不同DNA濃度FY2的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 5 PCR amplification results of specific primers on different concentrations of DNA of FY2

3 討論

有學(xué)者曾針對遠(yuǎn)志藥材的基原進(jìn)行過深入研究,傳統(tǒng)的鑒定方法包括:基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定以及理化鑒定等[6,7],現(xiàn)代的鑒定方法則包括:薄層色譜法[17]、紫外光譜法[17]、HPLC指紋圖譜法[18]、DNA條形碼鑒定[12,13]等。中藥鑒定技術(shù)貫穿于中藥材種植、加工、生產(chǎn)等各個(gè)環(huán)節(jié),隨著中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,傳統(tǒng)鑒定方法已經(jīng)難以滿足醫(yī)院、藥店、企業(yè)、海關(guān)等各行業(yè)快速、標(biāo)準(zhǔn)的鑒定需求,因此需要建立新的鑒定方法。陳士林等[19,20]提出建立以ITS2為核心、psbA-trnH為補(bǔ)充序列的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系。然而由于DNA測序技術(shù)復(fù)雜、成本高,目前在全國推廣應(yīng)用還有一定的局限性。

本文的研究目的是在無需對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序的情況下,利用特異性PCR引物,快速、準(zhǔn)確地從未知遠(yuǎn)志樣品中鑒別出FY2,為FY2的分子鑒定提供依據(jù)。通過對遠(yuǎn)志rDNA ITS序列進(jìn)行分析,尋找FY2的rDNA ITS序列堿基差異位點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出4對特異性PCR鑒別引物,上述特異性引物能以FY2為模板DNA擴(kuò)增出一條約463 bp左右的DNA片段。該特異性PCR引物鑒別方法具有成本小、用時(shí)短、效率高、操作簡便、特異性好、靈敏度高、無需測序等優(yōu)點(diǎn),只需通過簡單的PCR反應(yīng)就可以有效地將FY2從其他遠(yuǎn)志中鑒別出來。這種方法具有準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點(diǎn),并且對操作人員的技術(shù)要求比較低,兼具靈敏度和適用性,可以制備成試劑盒推廣應(yīng)用,服務(wù)于我國各級藥監(jiān)部門的日常檢查及抽查工作,具有廣闊的應(yīng)用前景。

JY1和FY2都是汾陽經(jīng)作所選育出來的新品種,這4對特異性引物為遠(yuǎn)志新品種的推廣提供了分子鑒別的便利。特異性引物的種內(nèi)適用性考察和靈敏度考察結(jié)果分別顯示:這4對特異性引物不僅可以檢測單個(gè)FY2樣品,還可以在混合物中檢測出FY2,適用范圍較廣;4對引物特異性PCR鑒定方法的靈敏度很高,含量極微弱的FY2也能夠被鑒定出來。

由于本文只考察了山西產(chǎn)(不同地區(qū)和不同生長方式)的遠(yuǎn)志和陜西產(chǎn)野生卵葉遠(yuǎn)志,未對其余產(chǎn)地的遠(yuǎn)志進(jìn)行考察,因此后續(xù)有待引入更多的遠(yuǎn)志品種及樣品進(jìn)行引物的適用性考察。