臭椿酮誘導(dǎo)人黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

陳小宇，陳 穎，曲傳俊，李德芳，鄭秋生,2*

1濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，煙臺(tái) 264000；2石河子大學(xué)藥學(xué)院 新疆特種植物藥資源省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一種極具侵襲性的腫瘤，好發(fā)于皮膚表面。皮膚惡性黑色素瘤的死亡率占皮膚相關(guān)腫瘤死亡率的80%[1]，其發(fā)生率與死亡率多年來一直高居不下[2,3]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，2012年全球黑色素瘤新發(fā)病例為232 000例，死亡55 000例，死亡率占新發(fā)病例的23.7%[4]；2011年我國(guó)黑色素瘤新發(fā)病例6 505例，死亡病例2 660例，死亡率占新發(fā)病例的40.9%[5]，黑色素瘤已成為嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的疾病之一，因此開發(fā)與研究黑色素瘤治療藥物顯得尤為重要。

臭椿Ailanthusaltissima(Mill.) Swingle，又名椿樹和木礱樹，屬落葉喬木，因葉基部腺點(diǎn)發(fā)散臭味而得名，其樹皮、根皮、果實(shí)均可入藥，具有清熱燥濕、收澀止帶、止瀉、止血之功效[6]。臭椿酮是臭椿樹葉中分離的一種苦味素類化合物，具有廣譜的生物活性，包括抗炎、抗HIV、抗瘧疾、抗過敏、抗?jié)兒涂刮⑸锏萚6]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮也具有抗腫瘤活性，并在人前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞[7]、人肝癌Huh7細(xì)胞[8]、人前列腺癌C4-2B細(xì)胞[9]、人胃癌SGC-7901細(xì)胞[10]、人非小細(xì)胞肺癌A549，H1299和H1975細(xì)胞[11]、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[12]、人早幼粒急性白血病HL-60細(xì)胞[13]中得以驗(yàn)證。但是，臭椿酮對(duì)黑色素瘤的影響未見報(bào)道。因此，本研究以人黑色素瘤A375細(xì)胞為研究對(duì)象，通過多種分子生物及生物化學(xué)手段檢測(cè)了臭椿酮對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，并探討了可能的分子機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

臭椿酮(Ailanthone，AIL)購(gòu)于寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶消化液購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和Hoechst 33258細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；caspase-3和caspase-9活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；p-PI3Kβ(Ser1070)，PI3Kβ，p-Akt (Ser473)，Akt和β-actin抗體購(gòu)自Cell signaling公司，山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。分析純化學(xué)試劑均購(gòu)自山東濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于Tecan公司，AXIO OBSERVER A1倒置熒光顯微鏡購(gòu)自Carl Zeiss AG公司，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，垂直電泳儀購(gòu)自Bio-RAD公司，UVP凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)BioSpectrum公司。

1.3 細(xì)胞及培養(yǎng)

人黑色素瘤A375細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代一次。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，以每孔4×103個(gè)接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。次日，待細(xì)胞貼壁后，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5 g/mL MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置于微孔振蕩器上振蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，用多功能酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度。并依據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%

2.2 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，加入0、4、8、12 μM臭椿酮，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.3 Hoechst 33258染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2～3次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，之后棄去固定液，用PBS潤(rùn)洗2次，吸出孔內(nèi)液體，加入Hoechst 33258染色液500 μL，室溫避光染色30 min，棄去染色液，用PBS潤(rùn)洗2次，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2～3次，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書上的操作收集細(xì)胞并分別加入Annexin V-FITC和PI，室溫避光染色20 min后。離心收集細(xì)胞，棄去熒光染液，用試劑盒中提供的緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，最后加入500 μL緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 Caspase-3和caspase-9的活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2次，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，600 g在4 ℃離心5 min收集細(xì)胞沉淀，加入200 μL試劑盒中提供的裂解液，冰浴裂解15 min，取該溶液于4 ℃用16 000 g離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。取待測(cè)溶液50 μL，加入40 μL檢測(cè)緩沖液及10 μL底物，于405 nm處測(cè)定樣品吸光度。把試劑盒提供的pNA(p-nitroaniline)(10 mM)稀釋至0、10、20、50、100 μM，每個(gè)濃度取100 μL并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔用酶標(biāo)儀在405 nm處進(jìn)行檢測(cè)，制作出pNA濃度相對(duì)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用樣品的A405的數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上比對(duì)，可以得到相應(yīng)的pNA濃度，用pNA濃度大小表示caspase-3和caspase-9活性的高低。

2.6 Westerm blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2次，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，600 g在4 ℃離心5 min收集細(xì)胞沉淀，加入800 μL RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min后，1 000 g在4 ℃離心10 min后取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，之后取適量蛋白溶液與上樣緩沖液按比例混勻，于沸水中煮15 min使蛋白變性，取40 μg蛋白上樣，采用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，之后用TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗于室溫在搖床搖2 h，用TBST潤(rùn)洗3次后用ECL發(fā)光試劑盒顯色，用UVP凝膠成像系統(tǒng)記錄圖像。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS 19.0軟件單因素方差(ANOVA)進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞活力的抑制作用

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，用MTT法檢測(cè)臭椿酮對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞活力的影響。如圖1所示，臭椿酮(4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，能夠明顯抑制A375細(xì)胞活力且呈現(xiàn)劑量依賴性。其中12 μM臭椿酮作用A375細(xì)胞24 h后，使A375細(xì)胞活力下降78.9%。

圖1 臭椿酮對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞活力的抑制作用Fig.1 Inhbitory effect of AIL in human melanoma A375 cells注：Ctrl為對(duì)照組，*與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)，**與對(duì)照組相比具有非常顯著差異(P<0.01)。Note:Ctrl means control group,*significant difference with control group (P<0.05),very significant difference with control group (P<0.01).

圖2 不同濃度臭椿酮作用A375細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.2 Morphological change of A375 cells treated with different concentrations of AIL for 24 h注：Ctrl為對(duì)照組。Note:Ctrl means control group.

3.2 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)變化。如圖2所示，臭椿酮作用后A375細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，并呈現(xiàn)劑量依賴性。隨著臭椿酮?jiǎng)┝康脑黾樱珹375細(xì)胞變的更圓，其中12 μM臭椿酮作用A375細(xì)胞24 h后，A375細(xì)胞明顯變小、數(shù)目變少，并且透光性降低，還使A375細(xì)胞的附著力變?nèi)?，上清液出現(xiàn)許多漂浮的細(xì)胞。

3.3 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞核形態(tài)的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，用Hoechst 33258熒光染料對(duì)A375細(xì)胞進(jìn)行染色來檢測(cè)AIL對(duì)A375細(xì)胞核形態(tài)的影響。如圖3所示，臭椿酮作用后細(xì)胞數(shù)目相較于正常組明顯減少(表現(xiàn)為細(xì)胞核數(shù)目減少)，還可以觀察到A375細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮進(jìn)而產(chǎn)生的高亮，而對(duì)照組細(xì)胞核亮度較低，邊緣光滑完整，染色質(zhì)分布均勻。

圖3 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞核形態(tài)的影響 (200 ×)Fig.3 The effect of AIL on cell nuclear feature in A375 cells (200 ×)注：Ctrl為對(duì)照組。Note:Ctrl means control group.

3.4 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，用Annexin V-FITC和PI染料進(jìn)行雙染，接著用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。如圖4所示，與正常組相比，臭椿酮作用組細(xì)胞凋亡率明顯增加，表現(xiàn)在Q4象限(早期凋亡)和Q2象限(晚期凋亡)細(xì)胞數(shù)均明顯增加。

圖4 臭椿酮能夠誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡Fig.4 AIL induced apoptosis of A375 cells注：Ctrl為對(duì)照組，PI為碘化丙啶，F(xiàn)ITC為異硫氰酸熒光素。Note:Ctrl means control group,propidine iodide is represented as PI,fluorescein isothiocyanate is represented as FITC.

3.5 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞caspase-3和caspase-9活性的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，與正常組對(duì)比，不同濃度臭椿酮作用后caspase-3和caspase-9的活性增加，其中8 μM和12 μM臭椿酮作用后，能夠使caspase-3的活性顯著增加，臭椿酮(4、8、12 μM)作用后能夠使caspase-9的活性顯著增加。

3.6 臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

臭椿酮(0、4、8、12 μM)作用A375細(xì)胞24 h后，用Western blot檢測(cè)臭椿酮作用后對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。如圖5所示，與對(duì)照組相比，不同濃度臭椿酮作用后p-PI3K和p-Akt表達(dá)明顯下降，說明臭椿酮能夠抑制PI3K和Akt的磷酸化，而PI3K和Akt總蛋白并無明顯變化。上述結(jié)果說明，臭椿酮能夠使PI3K/Akt信號(hào)通路失活。

Table 1 Effect of AIL on caspase-3 and caspase-9 activities in A375 cells (n =

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

圖5 臭椿酮作用A375細(xì)胞后對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of AIL on the expression of PI3K/Akt signaling pathway proteins in A375 cells注：Ctrl為對(duì)照組。Note:Ctrl means control group.

圖6 臭椿酮聯(lián)合LY294002對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of AIL combined with LY294002 on the expression of PI3K/Akt signaling pathway proteins注：Ctrl為對(duì)照組。Note:Ctrl means control group.

3.7 臭椿酮使PI3K/Akt信號(hào)通路失活來誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡

LY294002是PI3K特異性抑制劑，用LY294002預(yù)處理2 h后，再加入0、4、8、12 μM臭椿酮作用A375細(xì)胞24 h，用Western blot檢測(cè)臭椿酮作用后對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。如圖6所示，臭椿酮作用A375細(xì)胞后對(duì)總PI3K和Akt的表達(dá)沒有明顯影響，但是使磷酸化PI3K和Akt表達(dá)明顯下降，當(dāng)臭椿酮和PI3K抑制劑LY294002聯(lián)用后，使磷酸化PI3K和Akt表達(dá)下降更為明顯，進(jìn)一步說明臭椿酮能夠使PI3K/Akt信號(hào)通路失活。

接著，我們又檢測(cè)了LY294002聯(lián)合臭椿酮對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)與只臭椿酮處理組相比，臭椿酮與LY294002聯(lián)用后使A375細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，進(jìn)一步確認(rèn)了臭椿酮通過使PI3K/Akt信號(hào)通路失活來誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。

圖7 臭椿酮通過PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡Fig.7 AIL induced apoptosis of A375 cells via PI3K/Akt signaling pathway注：Ctrl為對(duì)照組，PI為碘化丙啶，F(xiàn)ITC為異硫氰酸熒光素。Note:Ctrl means control group,propidine iodide is represented as PI,fluorescein isothiocyanate is represented as FITC.

4 結(jié)論

黑色素瘤是一種惡性程度相當(dāng)高的腫瘤，大多原發(fā)于皮膚，也可起源于眼、鼻腔等處，早期可發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位多見肺、腦，黑色素瘤的死亡率之高已嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康。因此，尋找低毒、高效的抗癌藥物是黑色素瘤治療領(lǐng)域的重要方向。

臭椿酮是臭椿中的一種化合物，具有抗炎、抗HIV、抗瘧疾、抗過敏、抗?jié)兒涂刮⑸锏纳锘钚?，還能夠通過提升自身免疫而發(fā)揮多種治療作用[6]。Zhuo等[8]發(fā)現(xiàn)臭椿酮能夠通過激活A(yù)TM/ATR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制人肝癌HepG2、Hep3B、Huh7細(xì)胞增殖并導(dǎo)致人肝癌細(xì)胞周期阻滯。He等[9]發(fā)現(xiàn)在難去勢(shì)的前列腺癌細(xì)胞中臭椿酮通過靶向p23克服MDV3100耐藥。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)臭椿酮通過誘導(dǎo)G2/M期阻滯和凋亡來抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖。Ni等[11]通過cDNA基因序列的方法探索了臭椿酮抑制非小細(xì)胞肺癌增殖的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)臭椿酮作用后會(huì)下調(diào)RPA1進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌DNA復(fù)制。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)臭椿酮能夠誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡和周期阻滯。Wei等[13]發(fā)現(xiàn)臭椿酮通過誘導(dǎo)凋亡和自噬抑制人早幼粒急性白血病HL-60細(xì)胞增殖。Rosati等[14]發(fā)現(xiàn)臭椿酮能夠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)下降并激活caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。目前尚未見有關(guān)臭椿酮對(duì)黑色素瘤影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以臭椿酮為研究對(duì)象，探討了臭椿酮對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制。

在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞和未凋亡的細(xì)胞有著明顯的形態(tài)變化，凋亡的細(xì)胞體積變小，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、附著力變?nèi)醯默F(xiàn)象。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)發(fā)生固縮，Hoechst 33258是一種著色于DNA的染料，因此在Hoechst 33258染色后，用熒光顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)致密濃染或碎塊化致密濃染，顏色發(fā)白呈現(xiàn)高亮[15,16]。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V是一種分子量為35～36 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。碘化丙啶(propidium iodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)于凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死的細(xì)胞，由于其細(xì)胞膜破裂，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅[17]。因此，用Annexin V和PI雙染能夠標(biāo)記凋亡細(xì)胞和壞死的細(xì)胞。Caspase-9也稱為ICE-LAP6或Mch6，是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中比較上游的一個(gè)caspase，線粒體釋放細(xì)胞色素C后，caspase-9可以和細(xì)胞色素C和Apaf1形成復(fù)合物，同時(shí)被激活。活化的caspase-9可以激活caspase-3從而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號(hào)[18,19]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭椿酮作用后使A375細(xì)胞變小、透光性降低，附著力變?nèi)醣憩F(xiàn)為上清液出現(xiàn)許多漂浮的細(xì)胞；Hoechst 33258染色后，用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)臭椿酮作用后能夠使A375細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)固縮，從而表現(xiàn)為熒光高亮；Annexin V-FITC/PI雙染后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)臭椿酮作用后使A375細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞占比均增高；用分光光度法檢測(cè)caspase-3和caspase-9的活性，發(fā)現(xiàn)臭椿酮作用后與正常組對(duì)比，能夠使caspase-3和caspase-9的活性明顯升高。以上結(jié)果說明臭椿酮能夠誘導(dǎo)人黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號(hào)通路通過多種途徑參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制主要有三個(gè)：(1)活化的Akt使促凋亡蛋白Bad磷酸化，使其與伴侶蛋白結(jié)合，從而阻斷其與Bcl-2形成二聚體，最終導(dǎo)致Bad促凋亡作用喪失；(2)調(diào)控細(xì)胞周期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Akt磷酸化可以激活其下游分子mTOR，激活的mTOR可以將信號(hào)傳遞給S6K1和4E-BP1，S6K1和4E-BP1活化后會(huì)使細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；(3)在凋亡信號(hào)的刺激下，線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Akt激活后能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而產(chǎn)生抗凋亡的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮作用A375細(xì)胞后，對(duì)總PI3K和Akt的表達(dá)沒有明顯影響，但是使磷酸化PI3K和Akt表達(dá)明顯下降，并且當(dāng)臭椿酮和PI3K抑制劑LY294002聯(lián)用后，使磷酸化PI3K和Akt表達(dá)下降更為明顯，并且凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增加，進(jìn)一步說明PI3K/Akt信號(hào)通路參與臭椿酮誘導(dǎo)的人黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡。

綜上所述，臭椿酮對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并且能夠誘導(dǎo)其凋亡，主要通過上調(diào)caspase-3和caspase-9的活性和使PI3K/Akt信號(hào)通路失活來實(shí)現(xiàn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，臭椿酮具有體外抗黑色素瘤細(xì)胞的作用，為開發(fā)抗黑色素瘤的藥物提供了理論依據(jù)。