人干擾素誘導(dǎo)蛋白10及趨化因子受體3在兒童難治性支原體肺炎患者中的表達(dá)及意義

張中興

（河南省舞陽縣人民醫(yī)院 兒科，河南 舞陽 462400）

肺炎支原體被認(rèn)為是年輕人和兒童社區(qū)獲得性肺炎中最重要的病原體之一。肺炎支原體引起支原體肺炎，也稱為非典型肺炎，已被許多醫(yī)生證實有不同的臨床特征［1］，占社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia, CAP）的7%～20%。5 歲以下的兒童通常伴有輕度上呼吸道癥狀，而年齡較大的患有支氣管肺炎兒童和青少年則需要住院［2］。肺炎支原體肺炎（mycoplasmal pneumoniae pneumonia,MPP）的癥狀與促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)有關(guān)。促炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的組織損傷包括細(xì)胞內(nèi)定位、直接細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)激活，并在肺炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［3］?？梢哉f肺炎支原體誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)在CAP 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，包括難治性肺炎支原體肺炎。人干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-inducibleprotein 10,IP-10）是一種經(jīng)典的γ-干擾素（interferon-γ, IFN-γ）誘導(dǎo)型趨化因子受體3（CXC-chemokine receptor 3,CXCR3）配體，是一種多功能趨化因子。其生理活性表現(xiàn)為受體CXCR3 通過從脾臟或骨髓中募集嗜中性粒細(xì)胞或T 細(xì)胞來調(diào)節(jié)組織炎癥，以啟動獲得性免疫應(yīng)答［4］。然而，關(guān)于難治性支原體肺炎誘導(dǎo)IP-10、CXCR3 表達(dá)的報道很少。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇對象為2015年1月至2019年1月在本院接受治療的支原體肺炎患兒，所有患兒均符合支原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中難治性支原體肺炎患兒臨床表現(xiàn)以及胸部影像學(xué)加重，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素應(yīng)用1 周以上無好轉(zhuǎn)。排除慢性肺疾病、呼吸道感染以及心肝腎疾病的患者，排除臨床資料不全的患者。依據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)將患兒分為兩組，支原體肺炎（mycoplasmal pneumoniae pneumonia,MPP）組患兒120 例，男80 例，女40 例；年齡6～12 歲，平均（9.12±1.53）歲；難治性支原體肺炎（refractory mycoplasmal pneumoniae pneumonia,RMPP）組40 例，男26 例，女14 例；年齡6～12 歲，平均（9.15±1.48）歲；兩組患兒性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究前均經(jīng)患兒家屬知情同意，并經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方法

所有患兒均接受大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、阿奇霉素序貫治療，RMPP 組加用糖皮質(zhì)激素、丙種球蛋白，治療前、治療7 d 后抽取患兒空腹血5 ml，Perocll 非連續(xù)密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測IP-10 及CXCR3 水平

實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測IP-10 及CXCR3 水平，采用Trizol 提取中性粒細(xì)胞RNA，測定純度，并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR采用20 μl 的反應(yīng)體系，其中2×SYBR?Premix Ex-Taq II 10 μl，上游（10 μmol）和下游（10 μmol）各0.5 μl，cDNA 1 μl，PCR 級高純水8 μl。采用ABI7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）進(jìn)行基因擴(kuò)增，引物序列由上海英駿公司提供。IP-10（BM955683.1）上游序列：5'-GAATTTGGGCCCCTTGGGAG-3'，下游序列：5'-AGTGGATGTTCTGACCCTGC， 產(chǎn)物 199 bp；CXCR3（NM_001504.2） 上 游 序 列 ： 5'-TACATGCACTGCTGCCTCAA-3'，下游序列：5'-AGTCAGACTGTGGGCGAAAG-3'， 產(chǎn)物225 bp；β -actin（NM_001101.5） 上 游 序 列 ： 5'-CTTCGCGGGCGACGAT-3'， 下游序列： 5'-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3'，產(chǎn)物104 bp。采用相對定量2-△△Ct法比較目的基因水平。

1.4 肺功能指標(biāo)

應(yīng)用德國耶格公司肺功能檢測儀檢測用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、第1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second,FEV1）及最大呼氣流量（peak expiratory flow,PEF）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較

兩組患者的性別、年齡、肺部啰音及咳嗽等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；RMPP 組患兒的高熱人數(shù)明顯高于MPP 組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組肺功能指標(biāo)比較

RMPP 組患兒的FVC、FEV1 及PEF 水平明顯低于MPP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組IP-10 及CXCR3 水平比較

RMPP 組患兒的IP-10 及CXCR3 mRNA 水平明顯高于MPP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 RMPP 組患兒治療前后肺功能以及IP-10 和CXCR3 mRNA 水平比較

治療后，患兒的FVC、FEV1、PEF 水平明顯升高，而IP-10 及CXCR3 mRNA 水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 IP-10 和CXCR3 與肺功能相關(guān)性

IP-10 與FVC、FEV1、PEF 水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.512、-0.473、-0.439）；CXCR3 與FVC、FEV1、PEF 水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.409、-0.398、-0.432）。

表2 兩組肺功能指標(biāo)比較（±s,L）

表2 兩組肺功能指標(biāo)比較（±s,L）

組別MPP組RMPP組t值P值例數(shù)120 40 FVC 87.12±4.68 75.12±5.89 13.130 0.000 FEV1 89.35±4.86 76.35±5.26 14.351 0.000 PEF 81.22±4.37 65.27±3.82 20.600 0.000

表3 兩組IP-10 及CXCR3 水平比較（±s）

表3 兩組IP-10 及CXCR3 水平比較（±s）

組別MPP組RMPP組t值P值例數(shù)120 40 IP-10 1.52±0.35 2.44±0.45 15.050 0.000 CXCR3 2.07±0.52 2.98±0.74 8.865 0.000

表4 RMPP 組患兒治療前后肺功能及IP-10 和CXCR3 mRNA 水平比較（±s）

表4 RMPP 組患兒治療前后肺功能及IP-10 和CXCR3 mRNA 水平比較（±s）

組別治療前治療后t值P值例數(shù)40 40肺功能FVC/L 75.12±5.89 90.38±6.24 11.248 0.000 FEV1/L 76.35±5.26 91.57±6.88 11.289 0.000 PEF/L 65.27±3.82 90.25±6.17 13.269 0.000 IP-10 2.44±0.45 2.11±0.38 3.544 0.001 CXCR3 2.98±0.74 2.15±0.65 5.330 0.000

3 討論

近年來，越來越多的難治性或嚴(yán)重甚至致命的肺炎支原體感染病例被報道。在現(xiàn)有的研究中，患有RMPP 的兒童的住院時間和發(fā)熱持續(xù)時間較長［5］。最近的一項研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類抗藥性肺炎支原體可導(dǎo)致臨床難治性肺炎，并進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重和復(fù)雜的肺炎。加用糖皮質(zhì)激素治療嚴(yán)重的RMPP 通常具有顯著的有益效果［6］。因此，為了有效預(yù)防疾病的進(jìn)展，早期診斷和篩查兒童嚴(yán)重的RMPP 對兒科醫(yī)生來說非常重要，并可以及時治療，包括選擇抗生素和使用糖皮質(zhì)激素。

一些臨床指標(biāo)有助于診斷嚴(yán)重的RMPP。一般而言，嚴(yán)重RMPP 可能伴有胸腔積液，而且發(fā)熱持續(xù)時間延長，并出現(xiàn)不應(yīng)性［7］。據(jù)報道，與沒有胸腔積液的患者相比，胸腔積液的MPP 患者可能具有更嚴(yán)重的MPP 形式［8］。其機制尚不清楚，一個可能的原因是由免疫異常引起的炎癥反應(yīng)［9］。實驗室檢查結(jié)果顯示，嚴(yán)重MPP 患者的C-反應(yīng)蛋白和乳酸脫氫酶水平升高。然而，這些指標(biāo)對于嚴(yán)重的MPP 是非特異性的［10］。盡管早期診斷對于避免延遲有效治療非常重要，但基于這些，在兒童疾病早期仍然很難區(qū)分MPP 和難治性的MPP。許多研究表明，過度炎癥反應(yīng)在RMPP 中起重要作用。IP-10 是一種經(jīng)典的IFN-γ 誘導(dǎo)型CXCR3配體，是一種多功能趨化因子［11］。而CXCR3 屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族，為常見的趨化因子受體，能與趨化因子IP-10 特異性結(jié)合，介導(dǎo)趨化因子效應(yīng)［12］。本研究中，RMPP 組患兒的IP-10 及CXCR3 mRNA 水平明顯高于MPP 組，這可能與患兒的免疫異常有關(guān)，尤其RMPP 組患兒的免疫異常更加嚴(yán)重，并導(dǎo)致IP-10 及CXCR3 mRNA 水平異常增加。

本研究中，RMPP 組患兒的FVC、FEV1 及PEF 水平明顯低于MPP 組，這也證實RMPP 組患兒的肺功能更差。而RMPP 組患兒接受糖皮質(zhì)激素、丙種球蛋白治療后，F(xiàn)VC、FEV1 及PEF 水平明顯增加，這也說明RMPP 患兒經(jīng)過糖皮質(zhì)激素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后，體內(nèi)的炎癥可以得到較好的控制，并進(jìn)一步改善患兒的肺功能。通過相關(guān)性分析顯示，RMPP 組患兒的IP-10 及CXCR3 水平分別與FVC、FEV1、PEF 水平顯示負(fù)相關(guān)，這說明IP-10 及CXCR3 水平在一定程度上能反映患兒的炎癥程度，并進(jìn)一步展現(xiàn)肺功能，可以將其作為反映患兒炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。