非小細(xì)胞肺癌患者熱休克蛋白90α、凋亡促進(jìn)因子Bax、凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)水平變化及與病理學(xué)特征的相關(guān)性

陳濤，杜維

（湖南省常德市第一人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.病理科，湖南 常德 415000）

流行病學(xué)研究表明，我國部分地區(qū)2010年至2017年非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的發(fā)病率可達(dá)284～583/1 萬人左右［1］。臨床上NSCLC 的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊邿o瘤生存時(shí)間和中位生存時(shí)間的下降，增加了患者短期內(nèi)的病死率［2-3］。

在探討NSCLC 的生物學(xué)進(jìn)展機(jī)制的過程中，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)調(diào)控蛋白的改變，能夠通過影響到癌細(xì)胞的凋亡、分化和增殖過程，進(jìn)而參與NSCLC 的病情進(jìn)展過程。熱休克蛋白90α（heat shock protein-90α, HSP90α）的表達(dá)上升，能夠通過影響癌細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄水平，提高了癌細(xì)胞的浸潤和黏附能力［4］；凋亡促進(jìn)因子Bax（Bcl-2 associated X） 與凋亡抑制因子Bcl-2（B cell lymphoma-2, Bcl-2）相關(guān)X 蛋白的表達(dá)，能夠通過激活癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞程序性凋亡比例的上升，促進(jìn)了腫瘤病灶的萎縮和腫瘤細(xì)胞的消退［5］；凋亡抑制因子Bcl-2 的B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因的表達(dá)，能夠通過影響到阻斷癌細(xì)胞內(nèi)第二信使的活性，提高癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄上游啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的持續(xù)性增殖，抑制肺泡上皮細(xì)胞的凋亡［6］。部分研究者探討了Bax、Bcl-2 的表達(dá)與NSCLC 的關(guān)系，認(rèn)為Bax、Bcl-2 的表達(dá)與NSCLC 的病情進(jìn)展密切相關(guān)［7］，但缺乏對(duì)于HSP90α 的表達(dá)與NSCLC 的臨床病理特征的關(guān)系研究。為了揭示HSP90α、Bax、Bcl-2 的表達(dá)與NSCLC 的病情關(guān)系，從而為臨床上NSCLC 患者的診療分析提供理論方面的參考，本次研究選取2012年1月至2017年12月本院保存的NSCLC 組織110 例，探討了HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達(dá)與肺癌的病情關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月至2017年12月本院保存的NSCLC 組織110 例（NSCLC 組），納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)確診；②手術(shù)前未行放化療等治療；③臨床病理資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料欠缺；②合并有其他惡性腫瘤者。同時(shí)選取手術(shù)切除的肺良性病變組織100 例作為對(duì)照組（其中肺大泡42 例，炎性假瘤33 例，支氣管擴(kuò)張25 例）。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，納入研究患者及其家屬都已知情同意。NSCLC 組和對(duì)照組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 NSCLC 組和對(duì)照組一般資料比較（±s）

表1 NSCLC 組和對(duì)照組一般資料比較（±s）

組別NSCLC組對(duì)照組t/χ2值P值例數(shù)110 100男/女/例65/45 60/40 0.018 0.893年齡/歲59.42±4.11 60.10±5.20-1.056 0.292體重指數(shù)/(kg/m2)22.43±3.21 22.79±3.05-0.831 0.407

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用石蠟進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，8%的蛋白粉封閉液（商品名：BSA購自南京博奧生物科技公司），封閉2 h，倒去封閉液后加入一抗（兔來源濃度1∶1 000～1 500），4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，加入二抗（鼠來源1∶400～500），室溫孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，滴加顯色劑（DAB 購自南京博奧生物科技公司），復(fù)染，脫水，封片。

1.3 結(jié)果判斷

HSP90α、Bax、Bcl-2 蛋白定位于胞漿，呈黃色顆粒狀；隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，總計(jì)500 個(gè)細(xì)胞，采用半定量積分法，對(duì)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性細(xì)胞比例：＜10%為1 分，10%～25%為2 分，26%～50%為3 分，≥51%為4 分。最終得分為染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例得分之積，分?jǐn)?shù)≥4 分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組和對(duì)照組HSP90α、Bax 和Bcl-2 表達(dá)比較

NSCLC 組HSP90α 和Bcl-2 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而Bax 蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2 和圖1。

2.2 HSP90α、Bax 和Bcl-2 表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理關(guān)系

III 期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HSP90α 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于I～I(xiàn)I 期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；腫瘤直徑＞3 cm 患者Bcl-2 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑≤3 cm 患者（P＜0.05）；中低分化患者Bax 蛋白陽性表達(dá)率明顯低于高分化患者（P＜0.05）。見表3。

表2 兩組HSP90α、Bax 和Bcl-2 蛋白陽性表達(dá)率比較 例（%）

圖1 免疫組化（×400）

表3 HSP90α、Bax 和Bcl-2 表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理關(guān)系 例（%）

續(xù)表3

2.3 HSP90α、Bax和Bcl-2表達(dá)相關(guān)性

NSCLC 組織HSP90α 和Bcl-2 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.626,P＜0.05）。見表4。Bax 與HSP90α 和Bcl-2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.609 和-0.594,P ＜0.05）。見表5。

表4 NSCLC 組織HSP90α 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表5 NSCLC 組織Bax 與HSP90α 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

環(huán)境污染、長(zhǎng)期吸煙或者家族性的遺傳易感基因的攜帶，均能夠促進(jìn)NSCLC 的發(fā)生，特別是在合并有長(zhǎng)期吸煙的男性群體中，NSCLC 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，遠(yuǎn)期的臨床轉(zhuǎn)歸更差［8］。長(zhǎng)期的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，NSCLC 綜合性治療措施治療后的5年生存率不足40%，遠(yuǎn)期的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率可明顯提高［9-10］。免疫靶向性治療能夠在NSCLC 的輔助治療過程中發(fā)揮重要的作用，而本次研究對(duì)于NSCLC 病灶組織中HSP90α、Bax 和Bcl-2 的探討，不僅能夠?yàn)镹SCLC 患者的病情評(píng)估提供參考，同時(shí)還能夠?yàn)镹SCLC 患者的免疫靶向性治療提供可能的作用靶點(diǎn)。

HSP90α 是熱休克家族相關(guān)成員，其能夠通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞的代謝障礙，促進(jìn)癌細(xì)胞核脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）的異常裂變，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HSP90α 能夠通過其對(duì)于糖蛋白末端的磷酸化修飾作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)的G1/S 期比例的異常，提高癌細(xì)胞快速跨越G0 期的能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的持續(xù)性DNA 分裂［11］?；A(chǔ)方面的研究還認(rèn)為，HSP90α 的上升能夠?qū)е掳┘?xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移能力的上升，增加了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)［12］；Bax 是腫瘤凋亡相關(guān)因子，其能夠通過影響到Bcl-2/Bax 比值，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的增殖和凋亡平衡，提高癌細(xì)胞的凋亡比例，增加癌細(xì)胞的壞死吸收的速度［13］；Bcl-2 是癌細(xì)胞凋亡負(fù)性調(diào)控因子，其能夠通過形成癌細(xì)胞內(nèi)的磷酸二聚體，進(jìn)而提高癌細(xì)胞的DNA 擴(kuò)增速度，降低癌細(xì)胞的凋亡速度。部分研究者探討了Bax 和Bcl-2 的表達(dá)與肺癌的關(guān)系，認(rèn)為二者的表達(dá)上升能夠促進(jìn)肺癌患者臨床分期的進(jìn)展，加劇肺癌患者臨床預(yù)后的惡化［7］，但缺乏對(duì)于HSP90α 與Bax或者Bcl-2 的相關(guān)關(guān)系的分析研究。

本次研究對(duì)于肺癌患者病灶組織中HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達(dá)分析研究可見，在病例組病灶組織中，HSP90α 及Bcl-2 蛋白的表達(dá)陽性率明顯上升，高于對(duì)照組，而Bax 蛋白的表達(dá)陽性率明顯下降，低于對(duì)照組，差異較為明顯，提示HSP90α、Bax 和Bcl-2 的異常表達(dá)均能夠參與NSCLC 的病情進(jìn)展過程。通過匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為這主要與HSP90α、Bax 和Bcl-2 的下列幾個(gè)方面的作用有關(guān)［14］：①HSP90α 的表達(dá)上升能夠促進(jìn)癌細(xì)胞DNA 錯(cuò)配修復(fù)能力的下降，導(dǎo)致癌細(xì)胞持續(xù)性自我增殖速度的提升；②Bax 的表達(dá)下降或者Bcl-2 的表達(dá)上升，能夠?qū)е掳┘?xì)胞凋亡信號(hào)通路的改變，抑制了癌細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致癌細(xì)胞G0/S 期細(xì)胞比例的下降，影響到了癌細(xì)胞的增殖和凋亡的平衡。張峻青等［15］研究者也認(rèn)為，在NSCLC 患者中，HSP90 的表達(dá)濃度可平均上升30%以上，特別是在合并有明顯的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)期病死率較高的患者中，HSP90 的表達(dá)濃度的上升更為明顯。免疫組化染色分析研究可見，在癌細(xì)胞異型性較為明顯的區(qū)域，HSP90α 和Bcl-2的染色強(qiáng)度較深，提示了相關(guān)指標(biāo)可能影響到了肺癌上皮細(xì)胞的異型性。在探討HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系過程中，已發(fā)現(xiàn)在臨床分期較晚或者合并有明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，HSP90α 的表達(dá)濃度可明顯上升，提示HSP90α 的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，這主要由于HSP90α 的表達(dá)上升能夠提高肺癌細(xì)胞浸潤和黏附能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程；在腫瘤直徑較大的肺癌患者中，Bcl-2的表達(dá)濃度明顯地上升，提示Bcl-2 的表達(dá)可能影響到了腫瘤病灶組織的增殖或者腫瘤細(xì)胞的富集，進(jìn)而增加了腫瘤直徑；在癌細(xì)胞分化程度較差的患者中，Bax 的表達(dá)濃度明顯地下降，提示Bcl-2的表達(dá)與肺癌患者的臨床病理特征同樣相關(guān)，這主要由于Bax 的表達(dá)能夠影響到肺癌細(xì)胞的分化成熟程度。最后本次研究發(fā)現(xiàn)，HSP90α 和Bcl-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，而與Bax 呈負(fù)相關(guān)，提示了3 種蛋白在影響到肺癌的病情進(jìn)展過程中可能發(fā)揮了一定的協(xié)同刺激作用。

綜上所述，在NSCLC 患者中，HSP90α 及Bcl-2 的表達(dá)明顯上升，而Bax 的表達(dá)明顯下降，同時(shí)HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達(dá)與肺癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)。后續(xù)相關(guān)臨床研究可以探討HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達(dá)與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。