細(xì)胞測溫技術(shù)及其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用前景

何偉男，嚴(yán)森，顧寧

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210000)

細(xì)胞是生命體結(jié)構(gòu)和功能最基本的單位，可分為原核細(xì)胞與真核細(xì)胞兩大類[1-2]。以真核細(xì)胞為例，細(xì)胞核負(fù)責(zé)合成和儲(chǔ)存DNA[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)合成和運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)[4]。線粒體和植物中的葉綠體主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生細(xì)胞能量，通過控制水解三磷酸腺苷 (ATP) 來釋放能量[5]，其中部分有ATP參與的生化反應(yīng)會(huì)引起線粒體跨膜電勢的改變，這與細(xì)胞內(nèi)熱的產(chǎn)生密切相關(guān)[6-7]。適宜的溫度是細(xì)胞生存和發(fā)展最基本的條件，由于細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，細(xì)胞溫度時(shí)刻發(fā)生變化[8]。細(xì)胞的增殖、分化、代謝活動(dòng)以及病理變化都會(huì)引起細(xì)胞溫度的波動(dòng)[9-11]。洞察活細(xì)胞溫度變化不僅有助于了解細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，而且能夠促進(jìn)疾病診斷和藥物研發(fā)技術(shù)的發(fā)展。本文從基于發(fā)光式細(xì)胞測溫和非發(fā)光式細(xì)胞測溫兩方面對(duì)細(xì)胞測溫技術(shù)進(jìn)行研究，并對(duì)其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 細(xì)胞溫度

細(xì)胞溫度在生命活動(dòng)中起著重要的作用，這使得細(xì)胞測溫技術(shù)成為前沿研究課題。細(xì)胞溫度相關(guān)的研究已經(jīng)逐漸深入到眾多生命科學(xué)研究領(lǐng)域，如圖1所示，近些年所發(fā)表的細(xì)胞溫度研究的論文涉及了生物化學(xué)、生物技術(shù)、生理學(xué)、藥理學(xué)等研究，體現(xiàn)了溫度在細(xì)胞生物研究領(lǐng)域的重要性。由于細(xì)胞的復(fù)雜特性，如何在微納尺度上實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定的溫度測量，成為目前亟待解決的問題[12]。1994年Kallerhoff團(tuán)隊(duì)[13]通過微量熱量計(jì)檢測了細(xì)胞群體的溫度變化，通過產(chǎn)熱功率的大小成功地區(qū)分出正常組織和癌癥組織。然而不同的組織之間，細(xì)胞的形態(tài)功能不同，甚至在同一組織中，細(xì)胞與細(xì)胞之間仍然存在差異 (物質(zhì)組成差異、結(jié)構(gòu)功能差異、基因表達(dá)差異、應(yīng)急響應(yīng)模式差異等)。對(duì)于細(xì)胞群體的分析往往忽略了細(xì)胞之間的差異性，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性較差。Paulik等[14]利用紅外熱成像技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)熱過程進(jìn)行了檢測，但由于細(xì)胞的不均勻性和極小尺寸導(dǎo)致紅外熱像儀無法獲取有效的信息。

圖1 細(xì)胞測溫應(yīng)用領(lǐng)域 (數(shù)據(jù)來源：Web of Science)

以單個(gè)細(xì)胞作為研究對(duì)象，能夠幫助研究者更好地了解細(xì)胞之間的差異性，掌握細(xì)胞群體中某些特殊的細(xì)胞功能。隨著單細(xì)胞分析技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞形貌、行為動(dòng)作、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物理性質(zhì)等均成為研究的熱門。細(xì)胞作為研究對(duì)象具有以下特點(diǎn)：細(xì)胞體積小 (直徑為10～20 μm)、信號(hào)微弱、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變以及細(xì)胞狀態(tài)敏感等。因此，細(xì)胞測溫技術(shù)需要滿足高靈敏性、高時(shí)空分辨率以及抗干擾能力等要求[15]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)出許多新型有效的測溫技術(shù)，包括有機(jī)熒光團(tuán)、量子點(diǎn)、微納熱電偶和一些復(fù)合材料等[16-19](見圖2)，Bai課題組[8]和Brites課題組[15]也分別做過細(xì)胞測溫技術(shù)方面的綜述。在先進(jìn)技術(shù)的支持下，細(xì)胞溫度的變化規(guī)律逐漸被掌握，尤其是在細(xì)胞受到外界刺激時(shí) (光熱刺激[20-22]、藥物刺激[23-24]、離子濃度變化[22,25]等) 產(chǎn)生的溫度變化，有望為藥物研發(fā)提供新的研究途徑。

圖2 細(xì)胞測溫技術(shù)

2 細(xì)胞測溫技術(shù)

2.1 發(fā)光式細(xì)胞測溫 光學(xué)成像技術(shù)一直是探究生物組織和細(xì)胞的有力手段，發(fā)光式細(xì)胞溫度計(jì)與現(xiàn)有的成像技術(shù)結(jié)合使細(xì)胞測溫成為可能。非侵入式和不需要接觸測量的優(yōu)點(diǎn)使其在特定場合得到廣泛使用。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，熒光探針的尺寸已經(jīng)達(dá)到納米尺度。發(fā)光式測溫方法可以通過測溫探針的熒光強(qiáng)度、最大發(fā)射波長或者熒光壽命變化將細(xì)胞溫度實(shí)時(shí)反映出來[15,26]，具有很好的空間分辨率、溫度分辨率以及數(shù)據(jù)收集能力。雖然熒光探針在穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確性上存在局限，但近年來一直是活細(xì)胞熱成像的研究重點(diǎn)。

1941年有機(jī)熒光團(tuán)被發(fā)現(xiàn)存在與溫度有關(guān)的特性[27]，Huang等[28]以DyLight549熒光團(tuán)作為溫度計(jì)，對(duì)靶向于表達(dá)TPRV1的細(xì)胞膜上特定蛋白的納米顆粒進(jìn)行溫度監(jiān)控，在射頻磁場的作用下，MnFe2O4磁性納米顆粒在短短15 s的時(shí)間內(nèi)溫度升高了15 ℃。監(jiān)測DyLight549熒光團(tuán)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞通道的局部產(chǎn)熱觸發(fā)了神經(jīng)元的動(dòng)作電位，從而激活了細(xì)胞的某種行為。該方法有望在不損傷細(xì)胞的同時(shí)操控細(xì)胞行為，為遠(yuǎn)程細(xì)胞診療提供一種新途徑。Suzuki等[25]利用填充熱敏熒光染料 (Eu-TTA) 的微玻璃管檢測了單個(gè)HeLa細(xì)胞的產(chǎn)熱，單個(gè)HeLa細(xì)胞在離子霉素的刺激下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度變化，從而引起細(xì)胞溫度的改變。實(shí)驗(yàn)中通過毒胡蘿卜素抑制了細(xì)胞Ca2+-ATPases的功能，添加離子霉素刺激胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)后，觀察到細(xì)胞溫度升高被抑制，這說明在細(xì)胞產(chǎn)熱的級(jí)聯(lián)過程中，Ca2+濃度以及Ca2+-ATPases起著關(guān)鍵作用，證實(shí)藥物刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞溫度發(fā)生變化。隨著熒光探針深入到亞細(xì)胞水平上，部分細(xì)胞器的溫度傳感器也被設(shè)計(jì)出來。Homma課題組[29]設(shè)計(jì)了由兩種羅丹明染料 (Rhodamine B和CS NIR dye) 組成的溫度探針 (Mito-RTP)，探針結(jié)合了二者的優(yōu)點(diǎn)，能夠融入到細(xì)胞的線粒體中，同時(shí)不受細(xì)胞生理環(huán)境的干擾。由于Rhodamine B染料的熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化有可逆的響應(yīng)，而CS NIR dye的熒光強(qiáng)度是恒定的，所以通過檢測這兩種染料熒光強(qiáng)度的比值變化，可以實(shí)時(shí)檢測線粒體的溫度情況。Arai團(tuán)隊(duì)[30]開發(fā)了一種選擇性靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光溫度計(jì) (ER thermo yellow)，溫度靈敏度達(dá)到3.9%/℃。該溫度計(jì)避免了聚集問題，可以均勻的將目標(biāo)細(xì)胞器染色，并通過改變細(xì)胞外部介質(zhì)的溫度，驗(yàn)證了結(jié)合ER thermo yellow的HeLa細(xì)胞的溫度敏感性。對(duì)于靶向細(xì)胞器的藥物來說，通過觀察溫度變化評(píng)估藥物作用效果不失為一種新的觀察視角。Uchiyama團(tuán)隊(duì)[31]致力于研發(fā)用于細(xì)胞溫度檢測的熒光探針，2011年首次向外公布了單個(gè)細(xì)胞的溫度圖譜 (見圖3)。通過熒光壽命成像顯微鏡，基于熒光聚合物溫度計(jì)的空間分辨率達(dá)到200 nm，溫度分辨率在0.18～0.58 ℃之間。觀測單個(gè)COS細(xì)胞溫度發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核與中心體的溫度明顯高于細(xì)胞質(zhì)，說明同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器之間存在著各自的溫度特性。

圖3 單細(xì)胞溫度圖譜

材料本身與溫度相關(guān)的特性可用于細(xì)胞溫度測量。通過光強(qiáng)變化以及發(fā)射峰位移，量子點(diǎn)能夠準(zhǔn)確地反映溫度波動(dòng)。例如Yang等[21]利用量子點(diǎn)的光致發(fā)光光譜繪制了Ca2+刺激和冷休克后NIH/3T3細(xì)胞內(nèi)的熱產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)部不均勻溫度的直接觀察，有利于實(shí)時(shí)掌握細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控的進(jìn)程。在雙光子激發(fā)下，硒化鎘 (CdSe) 量子點(diǎn)發(fā)射光的溫度靈敏度更高，熱成像質(zhì)量更好，Maestro等[32]成功應(yīng)用于單個(gè)HeLa細(xì)胞的溫度測量。與量子點(diǎn)不同，納米級(jí)金屬團(tuán)簇的熒光壽命在生理范圍內(nèi)會(huì)隨著溫度的變化而變化。納米金屬團(tuán)簇?fù)碛懈〉某叽纭⒘己玫纳锵嗳菪砸约拜^高的溫度敏感性，同樣也被認(rèn)為是一種優(yōu)良的熒光溫度計(jì)[33]，常見的主要有金納米團(tuán)簇[34]、銅納米團(tuán)簇[35]等。Shang團(tuán)隊(duì)[34]將脂酸包裹的金納米團(tuán)簇 (AuNCs) 通過內(nèi)吞作用導(dǎo)入到HeLa細(xì)胞中，當(dāng)改變細(xì)胞周圍環(huán)境溫度時(shí)，來自HeLa細(xì)胞內(nèi)部的AuNCs產(chǎn)生了600～1 000 ns的熒光壽命，并且隨著溫度的升高，熒光壽命明顯降低?；谏锓肿尤绲鞍踪|(zhì)[36]和DNA[37-38]的溫度計(jì)，能夠準(zhǔn)確地嵌入到細(xì)胞內(nèi)部。Donner等[36]將綠色熒光蛋白 (GFP) 作為溫度納米探針，在轉(zhuǎn)染GFP的癌細(xì)胞上進(jìn)行了測試，利用細(xì)胞周圍的金納米棒加熱細(xì)胞，檢測熒光偏振各向異性，實(shí)現(xiàn)了溫度的實(shí)時(shí)表征。這種方法為分子生物學(xué)的診斷與治療提供了非侵入式的有效工具。

2.2 非發(fā)光式細(xì)胞測溫 本節(jié)主要介紹微納尺度下的溫度測量工具，其溫度特性與發(fā)光無直接關(guān)系。1986年，Williams和Wickramasinghe發(fā)明了一種超高空間分辨率的測溫設(shè)備，被稱為掃描熱顯微鏡[39]。掃描熱探針在掃描隧道顯微鏡以及原子力顯微鏡的平臺(tái)上得以發(fā)揮作用，基于熱電效應(yīng)及其它物理性質(zhì)的微納探針可用于檢測物體表面的溫度。Sadat等[40]基于原子力顯微鏡 (AFM)，利用鍍鉑的AFM懸臂創(chuàng)建點(diǎn)接觸熱電偶，將接觸點(diǎn)電壓值與局部溫度聯(lián)系起來，擁有小于100 nm的空間分辨率和10 mK的溫度分辨率。Haeberle等[41]改進(jìn)AFM的懸梁臂，采用焦耳加熱的電阻器提高熱導(dǎo)率測量中的分辨率，通過對(duì)脂質(zhì)體、人體毛發(fā)和膠原樣品的熱導(dǎo)率測定，證實(shí)了該方法的可行性。隨著氣相沉積以及光刻技術(shù)的發(fā)展，一些傳統(tǒng)的溫度計(jì)實(shí)現(xiàn)了納米尺度的溫度觀測。普通K型熱電偶的熱電系數(shù)在0.04 mV·℃-1左右，而利用聚焦離子束輔助氣相沉積技術(shù)制備的納米金屬熱電偶則具有超高的熱電系數(shù)[42]，對(duì)鎢鉑納米金屬結(jié)表征，其熱電系數(shù)為5.4 mV·℃-1，這證實(shí)了微納熱電偶作為細(xì)胞測溫工具的潛力。Wang等[23]通過電化學(xué)腐蝕法將鎢棒腐蝕出納米級(jí)別的針尖，利用有機(jī)溶劑四氫呋喃溶解聚氨酯，包裹在腐蝕后的鎢棒表面作為絕緣層。利用真空離子濺射儀，在絕緣層上均勻地濺射一層100 nm厚度的金屬鉑層，巧妙地將熱電偶結(jié)構(gòu)集中在納米尺度的針尖上。利用顯微鏡與顯微操作儀，首次實(shí)現(xiàn)了鎢鉑熱電偶的單細(xì)胞測溫功能。Shrestha團(tuán)隊(duì)[43]為追求低成本，易開發(fā)的熱傳感器，改造了玻璃微量吸液管，將低熔點(diǎn)的焊料合金 (Sn) 作為芯材置于玻璃管內(nèi)，并在管外鍍鎳薄層，最終在玻璃管尖端構(gòu)建了熱電偶結(jié)。通過將制備好的熱電偶插入到視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，測量了瞬態(tài)的細(xì)胞溫度變化。以熱電效應(yīng)為基礎(chǔ)的測溫工具在溫度分辨率和時(shí)間分辨率上表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢，為細(xì)胞測溫研究的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。

Gao等[44]在碳納米管內(nèi)填充液態(tài)鎵制備了新型納米溫度計(jì)，其工作原理與水銀溫度計(jì)相似，通過觀測液態(tài)鎵的熱膨脹來測量溫度。Li等[45]直接將細(xì)胞培養(yǎng)在只有2 mm大小的鉑電阻上，利用鉑電阻的溫度敏感性將附著在電阻表面的細(xì)胞溫度檢測出來。該測溫裝置增加了信號(hào)收發(fā)模塊，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞溫度的無線測量。待測細(xì)胞連同測溫裝置一同放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中，確保待測細(xì)胞處于最合適的生存環(huán)境。Inomata等[46]開發(fā)了一種獨(dú)特的測溫方法，利用微流控技術(shù)制備了一個(gè)只能容納單個(gè)細(xì)胞通過的流道，當(dāng)細(xì)胞流動(dòng)到特定位置，細(xì)胞產(chǎn)生的熱量會(huì)傳遞到一個(gè)真空室內(nèi)，室內(nèi)的硅諧振熱傳感器會(huì)根據(jù)溫度的變化而改變諧振器的諧振頻率。該裝置成功應(yīng)用到單個(gè)棕色脂肪細(xì)胞的溫度檢測，整個(gè)過程持續(xù)了20 min。

活細(xì)胞本身能夠感知溫度變化，并由此來激活某些蛋白。細(xì)胞溫度的傳感是由蛋白質(zhì)、核酸和mRNAs來完成的，通過修改其構(gòu)象結(jié)構(gòu)來響應(yīng)溫度變化[47]。Narberhaus等[48]證實(shí)RNA溫度計(jì)是細(xì)胞中感知溫度的主要方式。RNA溫度計(jì)位于RNA結(jié)構(gòu)的某些特定區(qū)域，在生理溫度范圍內(nèi)保護(hù)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的未翻譯區(qū)域。當(dāng)細(xì)胞溫度下降，細(xì)胞會(huì)激活冷休克蛋白的表達(dá)。這些mRNA蛋白經(jīng)過結(jié)構(gòu)重排，在低溫下形成熱力學(xué)上更穩(wěn)定、不易降解的構(gòu)象，有利于細(xì)胞的存活。Shah等[49]計(jì)算了不同溫度下RNA結(jié)構(gòu)的分布，比較近100種隨機(jī)選擇的mRNA并探究了它們的熱敏特性，建立了一種研究RNA隨溫度變化的新方法。

在過去的研究中，用于細(xì)胞內(nèi)溫度測量的技術(shù)得到了發(fā)展。隨著人們認(rèn)知的提高，細(xì)胞生物學(xué)研究、疾病診斷治療以及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都對(duì)細(xì)胞測溫提出了更高的要求。基于發(fā)光式的溫度計(jì)中，有機(jī)熒光物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生理環(huán)境要求高，容易受到光漂白的限制，導(dǎo)致無法長時(shí)間檢測溫度；量子點(diǎn)由于自身存在不穩(wěn)定的毒性，不均一的形態(tài)影響發(fā)光分布；侵入式的熱電偶雖然精度高，響應(yīng)速度快，不易受細(xì)胞環(huán)境干擾，但是此測量方法往往會(huì)損壞細(xì)胞的完整性；基于生物結(jié)構(gòu)的溫度計(jì)，往往選擇性高，不能有效地應(yīng)用到其他細(xì)胞中。因此，細(xì)胞測溫技術(shù)仍處于初級(jí)階段，還需要進(jìn)一步的探索。

3 基于細(xì)胞溫度檢測的藥物研發(fā)前景

3.1 藥物篩選 藥物研發(fā)是對(duì)潛在藥物的識(shí)別、發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)和合成，必須在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行廣泛的表征和生物活性以及安全性的評(píng)估測試，然后才能在人體上進(jìn)行一系列的臨床實(shí)驗(yàn)，最終將所有的實(shí)驗(yàn)信息匯總進(jìn)行審批。研究表明，藥物研發(fā)從發(fā)現(xiàn)測試到最終的審批過程平均需要10～15年的時(shí)間，這是一個(gè)漫長且充滿風(fēng)險(xiǎn)的過程。藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)需要大量的資源和時(shí)間，新藥開發(fā)的成本也在不斷增加。藥物研發(fā)不僅要達(dá)到預(yù)防和治療疾病的要求，還要在安全性、可靠性等方面提供保障。藥物篩選作為藥物研發(fā)階段的關(guān)鍵一步，決定著整個(gè)研發(fā)過程的進(jìn)展。細(xì)胞測溫技術(shù)不僅可以快速獲取準(zhǔn)確的細(xì)胞信息，而且能夠從細(xì)胞甚至亞細(xì)胞層面提高藥物篩選效率，加快研發(fā)進(jìn)展。

隨著技術(shù)的發(fā)展和各學(xué)科領(lǐng)域之間的相互配合，有效藥物的發(fā)現(xiàn)過程變得更加順利。細(xì)胞內(nèi)溫度的變化可以反映細(xì)胞在受到內(nèi)外界刺激下的許多信息。這種新維度的評(píng)估方式對(duì)于目前的藥物篩選有著重要啟發(fā)。事實(shí)上細(xì)胞之間是存在差異性的，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成以及基因的表達(dá)均有不同。過去，由于技術(shù)水平的限制，樣品分析往往針對(duì)細(xì)胞群體，導(dǎo)致細(xì)胞特異信號(hào)的平均化。隨著細(xì)胞測溫技術(shù)的引入，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行信號(hào)檢測、藥物篩選成為可能。例如Wang等[23]通過微納熱電偶測量了單個(gè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 (U251) 在加入不同抗腫瘤藥物后的溫度變化，其中只有在加入喜樹堿 (CPT) 后，細(xì)胞溫度升高了0.5 ℃左右 (見圖4)。相同的結(jié)果由Gota團(tuán)隊(duì)[24]在COS7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，喜樹堿是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的抑制劑，在細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制過程中造成細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。作為細(xì)胞周期特異性藥物，喜樹堿對(duì)S期階段的細(xì)胞具有更明顯的影響，這一特性在溫度檢測中被證實(shí)。Zohar團(tuán)隊(duì)[50]利用熱成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿刺激后的細(xì)胞可以產(chǎn)生一種被阿托品阻斷的雙相熱波，而阿托品本身可以在細(xì)胞中產(chǎn)生單相熱波，表明它與受體的相互作用同時(shí)激活了細(xì)胞的一些代謝途徑。溫度的變化與藥物的作用機(jī)制相對(duì)應(yīng)，因此可以通過對(duì)細(xì)胞溫度進(jìn)行監(jiān)測實(shí)現(xiàn)藥物的篩選。

圖4 喜樹堿(CPT)刺激后細(xì)胞溫度變化[23]

3.2 藥物分析 在藥物研發(fā)過程中，對(duì)于藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和治療效果的分析評(píng)估也至關(guān)重要。在藥物研發(fā)的初期，通過體外模擬藥物在體內(nèi)的作用過程，不僅節(jié)約了成本而且簡單高效。在藥物分析過程中，為了檢測藥物作用效果以及安全性，需要定量分析藥物在細(xì)胞內(nèi)的吸收、分布以及代謝的規(guī)律。然而細(xì)胞的生長和分化過程復(fù)雜多變，傳統(tǒng)的技術(shù)手段不能實(shí)時(shí)有效地反映藥物作用過程。細(xì)胞測溫技術(shù)通過監(jiān)測熱量的方式獲取空間和時(shí)間分辨率的信息，實(shí)時(shí)追蹤特定細(xì)胞的信號(hào)更新。隨著測量分辨率的進(jìn)一步提高，藥物在細(xì)胞水平上的定位成為可能，這也是目前藥物研究中一個(gè)重要的信息缺口，多樣的測溫技術(shù)在精準(zhǔn)定量分析和追蹤藥物功效方面將會(huì)展現(xiàn)出巨大的潛力。隨著技術(shù)的革新，細(xì)胞測溫技術(shù)的分析已經(jīng)達(dá)到亞細(xì)胞的水平，可以實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及細(xì)胞核等全方位的溫度監(jiān)控，從而精確監(jiān)測藥物作用細(xì)胞后的動(dòng)態(tài)變化。例如前文介紹的Uchiyama小組[31]通過熒光壽命繪制了單個(gè)細(xì)胞的溫度分布，可以清晰地觀測到各個(gè)細(xì)胞器的溫度，證實(shí)處于不同活躍狀態(tài)的細(xì)胞器之間的溫度是不同的，頻繁進(jìn)行生化反應(yīng)的場所 (細(xì)胞核、線粒體等) 反映出更高的熱量變化。Takei團(tuán)隊(duì)[51]通過特制的比色納米溫度計(jì)成功地追蹤到由離子霉素引起的單個(gè)細(xì)胞的溫度變化。離子霉素是對(duì)鈣離子有親和力的離子載體，在細(xì)胞中會(huì)引起鈣離子濃度改變從而導(dǎo)致細(xì)胞溫度變化，不同部位溫度的升高表明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了不同程度的熱量 (見圖5)，從溫度視角分析藥代動(dòng)力學(xué)，有助于評(píng)估藥物作用的詳細(xì)靶點(diǎn)。Inomata團(tuán)隊(duì)[46]探究了去甲腎上腺素對(duì)棕色脂肪細(xì)胞的影響，刺激后的細(xì)胞持續(xù)釋放熱量，可用于統(tǒng)計(jì)藥物作用的反應(yīng)時(shí)間。Gota團(tuán)隊(duì)[24]和Suzuki團(tuán)隊(duì)[25]等分別嘗試了通過調(diào)控細(xì)胞代謝產(chǎn)物濃度來改變細(xì)胞溫度，相似的藥物作用機(jī)理也可以通過細(xì)胞溫度改變來逆向推導(dǎo)，有利于藥物功效的準(zhǔn)確分析。

圖5 離子霉素誘導(dǎo)下細(xì)胞溫度非均勻變化

3.3 治療方案設(shè)計(jì) 臨床上治療方案的設(shè)計(jì)直接影響藥物發(fā)揮的效果。對(duì)于用藥時(shí)間、最佳劑量以及給藥間隔的把控在藥物研發(fā)中需要得到足夠的重視。通過體外細(xì)胞模擬測試，可以方便的探究最佳的用藥條件。為了更加有效地治療，相比于大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)，治療應(yīng)針對(duì)于個(gè)別病例，甚至精準(zhǔn)到個(gè)別病變組織。針對(duì)性的細(xì)胞溫度-給藥模型能夠提供相關(guān)疾病的詳細(xì)熱力學(xué)信息，從而改進(jìn)個(gè)性化醫(yī)療，促進(jìn)精準(zhǔn)治療的發(fā)展。細(xì)胞熱量的變化程度與藥物作用效果聯(lián)系起來，是一種新的定量分析手段。為探究炎癥發(fā)生機(jī)制以及炎癥治療的最佳給藥濃度，Li等[52]在體外培養(yǎng)了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HMEC-1)，利用內(nèi)毒素 (LPS) 刺激人微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HMEC-1) 來觸發(fā)炎癥反應(yīng)，證實(shí)當(dāng)LPS濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，炎癥效果最明顯，此時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的溫度變化也最強(qiáng)烈。接著，他們以同樣的方式檢測發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素在1 μmg·L-1濃度下炎癥修復(fù)效果最好，證實(shí)了藥物在發(fā)揮最佳功效時(shí)存在合理的濃度范圍 (見圖6)。細(xì)胞的產(chǎn)熱過程與細(xì)胞活動(dòng)有著密切聯(lián)系，細(xì)胞溫度變化程度可以作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，用于分析各種細(xì)胞生理活動(dòng)。通過細(xì)胞溫度-給藥模型的建立，將有助于制定合理有效的臨床治療方案。

圖6 不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞溫度影響[52]

此外，通過檢測癌細(xì)胞對(duì)溫度刺激的反饋信息也是改進(jìn)治療方案的有效手段。Yang等[21]利用量子點(diǎn)監(jiān)控了細(xì)胞受到冷刺激下的溫度變化，證實(shí)活細(xì)胞對(duì)冷刺激有一定的應(yīng)激抵御能力。Bendix等[53]直接測量了細(xì)胞磷脂雙分子層的溫度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)溫度升高過程的精確控制。在癌癥熱療技術(shù)中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞被加熱超過40 ℃時(shí)即可被殺死，但正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞交替混合，需要實(shí)現(xiàn)精確的局部靶向加熱。Kucsko團(tuán)隊(duì)[54]將局部光致熱源納米金顆粒與敏感的納米尺度溫度計(jì)金剛石納米晶體 (Nanodiamonds) 結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)定位以及對(duì)局部細(xì)胞溫度的實(shí)時(shí)監(jiān)控，測量并調(diào)控了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的產(chǎn)熱梯度，實(shí)現(xiàn)了在不損傷周圍細(xì)胞的同時(shí)識(shí)別并殺死腫瘤細(xì)胞。因此，靈活多樣的細(xì)胞測溫技術(shù)為臨床疾病的治療提供了更多的解決方案。

4 結(jié)語

本文總結(jié)了一些具有代表性的測溫技術(shù)及其在細(xì)胞生物領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用，可以預(yù)見細(xì)胞測溫技術(shù)在藥物研發(fā)領(lǐng)域有著廣闊的前景，通過結(jié)合生物手段，細(xì)胞測溫技術(shù)將能夠應(yīng)用到藥物靶向、藥物緩釋、新藥開發(fā)等領(lǐng)域。目前，細(xì)胞測溫技術(shù)正處在一個(gè)發(fā)展的階段，隨著微納加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞測溫領(lǐng)域未來的趨勢必將是多學(xué)科的結(jié)合應(yīng)用，例如材料設(shè)計(jì)、熱力學(xué)、納米技術(shù)、微電子學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等。在后續(xù)的研究中，我們需要持續(xù)關(guān)注細(xì)胞測溫的技術(shù)革新，提高測溫裝置的性能，追求多種測溫手段的相互結(jié)合。在生物應(yīng)用中，我們要深入發(fā)掘細(xì)胞溫度所蘊(yùn)含的生物信息，推動(dòng)藥物篩選、藥物分析以及治療方案設(shè)計(jì)等多個(gè)方面的發(fā)展，從而加快新藥研發(fā)的進(jìn)程。在多學(xué)科領(lǐng)域的配合下，細(xì)胞測溫技術(shù)必將成為細(xì)胞生物學(xué)或生命科學(xué)發(fā)展的有力工具。