尖孢鐮刀菌的分離鑒定及不同苜蓿品種芽期抗病性

劉香萍 敬雪敏 閆紅秀 羅英花 許美花

摘要 為了解黑龍江省大慶市苜蓿根腐病的病原，評(píng)價(jià)不同苜蓿品種芽期對(duì)根腐病的抗病性，于2018年采集疑似感染根腐病的苜蓿病株，對(duì)其進(jìn)行了病原分離與鑒定。將鑒定得到的致病菌接種于18個(gè)品種的紫花苜蓿幼芽，測(cè)定相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗長(zhǎng)、發(fā)病率和病情指數(shù)，利用隸屬函數(shù)進(jìn)行抗病性綜合評(píng)價(jià)。形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析結(jié)果表明，分離獲得的致病菌為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，其對(duì)不同苜蓿品種芽期相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗長(zhǎng)、發(fā)病率和病情指數(shù)均有顯著影響（P<0.05）。說(shuō)明尖孢鐮刀菌對(duì)苜蓿有較強(qiáng)致病性?？共⌒跃C合評(píng)價(jià)表明： 不同苜蓿品種芽期對(duì)尖孢鐮刀菌根腐病抗性由強(qiáng)到弱依次為：‘龍牧801 > ‘斯貝德 > ‘SK3010 > ‘巨能-CR >‘肇東> ‘DS310FY > ‘WL168HQ > ‘WL354HQ> ‘TG4> ‘WL319HQ> ‘擎天柱 > ‘WL298HQ > ‘龍牧806 > ‘北極星 > ‘皇后 > ‘北極熊 > ‘CW2000 > ‘敖漢。

關(guān)鍵詞 苜蓿; 根腐病; 尖孢鐮刀菌; 分子鑒定; 抗病性

中圖分類(lèi)號(hào)： S 435.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018428

Abstract In order to understand the pathogens of alfalfa root rot in Daqing of Heilongjiang province， and to evaluate the resistance of different alfalfa varieties to root rot during the bud stage， the alfalfa roots showing symptoms of root rot were collected， and pathogens were isolated and identified in 2018. Based on morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis， the pathogen was identified as Fusarium oxysporum. The pathogen was inoculated into alfalfa sprouts of 18 varieties. The relative root length， relative seedling length， morbidity and disease index were measured to evaluate disease resistance by comprehensively analyzing subordinative function. The results showed that F.oxysporum had significant effects on relative root length， relative seedling length， morbidity and disease index of different alfalfa varieties （P<0.05） during the bud stage，indicating that F.oxysporum had strong pathogenicity to alfalfa. The comprehensive evaluation of disease resistance showed that the resistance order of alfalfa varieties during the bud stage to F.oxysporum from strong to weak was ‘Longmu 801>‘Sibeide>‘SK3010>‘Juneng-CR>‘Zhaodong>‘DS310FY>‘WL168HQ>‘WL354HQ>‘TG4>‘WL319HQ>‘Qingtianzhu>‘WL298HQ>‘Longmu 806>‘North Star>‘Queen>‘Polar Bear>‘CW2000>‘Aohan.

Key words alfalfa; root rot; Fusarium oxysporum; molecular identification; disease resistance

紫花苜蓿Medicago sativa L.屬豆科多年生草本植物，是世界上種植最為廣泛的牧草之一，它具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富、草質(zhì)優(yōu)良、家畜易于消化等特點(diǎn)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值居牧草之首，有“牧草之王”的美譽(yù)[1]。紫花苜蓿根系發(fā)達(dá)，一次種植可利用多年，可用于生態(tài)恢復(fù)改良干旱和輕度鹽堿土壤。但因利用年限較長(zhǎng)，根腐病不僅影響當(dāng)年苜蓿產(chǎn)量，對(duì)第2年返青及其多年生特性都有較大影響，已成為苜蓿產(chǎn)量下降和植株衰敗的一個(gè)極其重要的原因[23]。根腐病是世界性病害，幾乎所有苜蓿產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。據(jù)估計(jì)，每年全世界由根腐病造成的產(chǎn)量損失在20%左右，有些嚴(yán)重發(fā)生的地塊甚至達(dá)到40%[45]。根腐病是由鐮刀菌引起的土傳真菌病害[6]，2003年，李敏權(quán)等[7]在對(duì)甘肅定西苜蓿根腐病病原的研究中發(fā)現(xiàn)了3種鐮刀菌，即尖孢鐮刀菌F.oxysporum、銳頂鐮刀菌F.acuminatum和半裸鐮刀菌F.semitectum，這是我國(guó)首次有關(guān)根腐病病原的系統(tǒng)的研究報(bào)道。尖孢鐮刀菌是苜蓿根腐病主要致病菌，它不僅可以在宿主植物中存活，還可在土壤和空氣中存活達(dá)10年以上，表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病性[8]。目前，苜蓿種苗對(duì)尖孢鐮刀菌的抗病性方面缺乏系統(tǒng)性研究。本試驗(yàn)在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)手段，測(cè)定了18個(gè)紫花苜蓿品種芽期對(duì)尖孢鐮刀菌的抗病性，以期為苜蓿抗根腐病品種的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與苜蓿品種來(lái)源

2018年6月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系苜蓿試驗(yàn)田進(jìn)行了根腐病調(diào)查采樣，苜蓿品種為‘龍牧801。將田間疑似病株挖出，并將主根維管束變褐壞死的根腐病根樣品（圖1）帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行致病菌分離與鑒定。

供抗病性評(píng)價(jià)苜蓿品種共18個(gè)，分別為‘CW2000、‘DS310FY、‘SK3010、‘WL168HQ、‘WL298HQ、‘WL319HQ、‘WL354HQ、‘敖漢、‘北極星、‘北極熊、‘皇后、‘巨能-CR、‘龍牧801、‘龍牧806、‘TG4、‘擎天柱、‘斯貝德和‘肇東，均由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.2 病原菌分離純化

病原菌分離采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行，通過(guò)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)、純化獲得分離菌株。再經(jīng)過(guò)平板涂布法進(jìn)行單孢分離，用斜面PDA培養(yǎng)基4℃冰箱中保種，待用。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

待菌絲長(zhǎng)成菌落之后，依據(jù)Booths鐮刀菌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[9]在顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態(tài)、厚垣孢子的有無(wú)及著生方式，并用測(cè)微尺測(cè)量孢子大小，同時(shí)進(jìn)行顯微照相。

1.4 病原菌致病性測(cè)定及再分離純化

根據(jù)柯赫氏法則，將單孢分離的菌株回接至健康的成株‘龍牧801，植株發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀一致，從癥狀完全一致的植株上分離、純化病原菌至PDA培養(yǎng)基，觀察再次分離、純化的菌株與接種菌株形態(tài)是否一致，形態(tài)一致的菌株為目標(biāo)病原菌。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

在形態(tài)學(xué)特征鑒定的基礎(chǔ)上，采用DNA提取試劑盒（OMEGA-D3390-01，OMEGA公司）提取菌株DNA。采用rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板為1 μL，上下游引物各0.3 μL，ddH2O 10.9 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，54℃退火30 s;72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物送交該公司測(cè)序。

獲得的rDNA-ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中的鐮刀菌rDNA-ITS序列進(jìn)行比較，利用MEGA 5軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.6 不同苜蓿品種芽期抗病性比較

1.6.1 病原菌接種

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌，1周后加5 mL無(wú)菌水至培養(yǎng)基上，用手術(shù)刀刮取菌絲，雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲，再加5 mL無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面殘留的菌絲，濾液即為孢子懸浮液，濃度為1×106個(gè)/mL。挑選各苜蓿品種中優(yōu)質(zhì)的種子約200粒，在無(wú)菌條件下用75%乙醇浸泡2 min，再用1%次氯酸鈉浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分，將種子均勻放置在放有雙層濾紙的9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，添加適量無(wú)菌水使種子吸飽水分進(jìn)行催芽。1～2 d后種子萌發(fā)，幼芽約1 cm時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼芽放置在新的放有雙層濾紙的9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿25粒。每個(gè)苜蓿品種分為A、B兩組，每組3個(gè)重復(fù)，A組為處理組，每皿注射3 mL的孢子懸浮液; B組為對(duì)照組，每皿注射3 mL無(wú)菌水。每天適量添加無(wú)菌水，保證幼芽吸水飽滿(mǎn)。待接種14 d后，測(cè)定根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和發(fā)病株數(shù)，根據(jù)病斑占根系面積的百分比進(jìn)行病害分級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為： 0級(jí)，無(wú)癥狀; 1級(jí)，根部變細(xì); 2級(jí)，根部病斑面積小于等于1/2; 3級(jí)，根部病斑面積大于1/2; 4級(jí)，全株腐爛（圖2）。

1.6.2 測(cè)定指標(biāo)

相對(duì)根長(zhǎng)=（菌液處理組根長(zhǎng)/對(duì)照組根長(zhǎng)）×100%;

相對(duì)苗長(zhǎng)=（菌液處理組苗長(zhǎng)/對(duì)照組苗長(zhǎng)）×100%;

發(fā)病率=（病株數(shù)/總株數(shù)）×100%;

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×該級(jí)代表值）/（總株數(shù)×最重級(jí)別代表值）×100。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用隸屬函數(shù)對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[10]。當(dāng)指標(biāo)與抗病性呈正相關(guān)用公式（1），當(dāng)指標(biāo)與抗病性呈負(fù)相關(guān)用公式（2）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d后菌落直徑為62.3～68.0 mm，氣生菌絲茂盛呈白色絮狀（圖3a），培養(yǎng)基底部為黃白色，氣生菌絲有隔，且具有側(cè)生分枝（圖3b）。不易產(chǎn)生小型分生孢子，無(wú)隔膜，大小（3.0～9.5）μm×（0.9～2.0）μm;產(chǎn)生的大型分生孢子（圖3c）多呈紡錘形，細(xì)長(zhǎng)，頂端微微彎曲，一般具有3～5個(gè)隔膜，大小（10.0～15.5）μm×（3.5～2.1）μm。培養(yǎng)后期，容易生成厚垣孢子（圖3d），菌絲膨大。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將該菌株鑒定為尖孢鐮刀菌。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

菌株經(jīng)提取DNA，利用ITS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到大小約560 bp的片段（圖4）。所獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該病原菌與登錄號(hào)為MG136705等尖孢鐮刀菌的ITS序列同源性為99%～100%。

在基于rDNA-ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中（圖5），病原菌與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的尖孢鐮刀菌聚為一類(lèi)，而與其他菌種距離較遠(yuǎn)，表明該病原菌屬于尖孢鐮刀菌。

2.3 不同苜蓿品種芽期抗病性評(píng)價(jià)

2.3.1 尖孢鐮刀菌對(duì)18個(gè)苜蓿品種芽期相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)苗長(zhǎng)的影響

受尖孢鐮刀菌侵染后，苜蓿芽期的相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)苗長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在一定程度上反映了苜蓿接種病原菌后的抗病性強(qiáng)弱，并且不同品種間存在顯著性差異（P<0.05）。從圖6可知，各品種相對(duì)根長(zhǎng)在0.39～0.96之間。其中相對(duì)根長(zhǎng)小于0.5的有‘敖漢、‘皇后和‘北極熊，相對(duì)根長(zhǎng)分別為0.39、0.40和0.41;大于0.95的有‘斯貝德，相對(duì)根長(zhǎng)為0.96;其他品種的相對(duì)根長(zhǎng)在0.5～0.95之間。各品種的相對(duì)苗長(zhǎng)在0.48～0.98之間。其中相對(duì)苗長(zhǎng)小于0.5的有‘敖漢，相對(duì)苗長(zhǎng)為0.48;大于0.95的有‘巨能-CR和‘WL354HQ，相對(duì)苗長(zhǎng)分別為0.95和0.98;其他品種的相對(duì)苗長(zhǎng)在0.5～0.95之間。

2.3.2 18個(gè)苜蓿品種芽期根腐病發(fā)病率

不同品種苜蓿芽期的發(fā)病率存在顯著差異（P<0.05）。從圖7可知，發(fā)病率在66.67%～100%之間，其中發(fā)病率最低的為‘龍牧801，發(fā)病率為66.67%; 而發(fā)病率達(dá)到95%的有6個(gè)苜蓿品種，分別為‘敖漢、‘CW2000、‘龍牧806、‘北極星、‘北極熊和‘皇后。

2.3.3 18個(gè)苜蓿品種芽期病情指數(shù)

不同苜蓿品種芽期對(duì)病原菌的抗性存在顯著差異。從圖8可知，各品種的病情指數(shù)變化范圍在25～68之間。病情指數(shù)在30以下的是‘龍牧801，其病情指數(shù)為25;病情指數(shù)在60以上的品種有：‘北極星、‘皇后、‘北極熊、‘CW2000和‘敖漢，‘敖漢的病情指數(shù)最高，為68。

2.3.4 18個(gè)苜蓿品種芽期對(duì)尖孢鐮刀菌抗病性綜合評(píng)價(jià)

以18個(gè)苜蓿品種芽期的相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)苗長(zhǎng)、發(fā)病率和病情指數(shù)4個(gè)指標(biāo)作為依據(jù)，采用隸屬函數(shù)法結(jié)合各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，綜合評(píng)價(jià)這18個(gè)苜蓿品種芽期對(duì)尖孢鐮刀菌的抗病性（表1）。D值代表抗病性的強(qiáng)弱，D值越大抗病性越強(qiáng)。排序結(jié)果表明，18個(gè)苜蓿品種芽期抗病性的強(qiáng)弱順序依次為‘龍牧801>‘斯貝德>‘SK3010>‘巨能-CR>‘肇東>‘DS310FY>‘WL168HQ>‘WL354HQ>‘TG4>‘WL319HQ>‘擎天柱>‘WL298HQ>‘龍牧806>‘北極星>‘皇后>‘北極熊>‘CW2000>‘敖漢。

3 討論

鐮刀菌形態(tài)復(fù)雜，易受外界環(huán)境影響發(fā)生變異，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察很難準(zhǔn)確鑒定到種。本研究用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方式，對(duì)樣本菌株進(jìn)行鑒定。其中的分子生物學(xué)用到的rDNA-ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域被普遍用來(lái)進(jìn)行真菌種間或種內(nèi)遺傳相似性的分子系統(tǒng)研究[1113]。

關(guān)于苜蓿苗期根腐病抗病性評(píng)價(jià)，黃寧等[14]用尖孢鐮刀菌接種了62個(gè)苜蓿品種的無(wú)菌苗，聚類(lèi)分析得到了抗病品種4個(gè)、中抗品種31個(gè)、感病品種27個(gè);辛寶寶等[15]用尖孢鐮刀菌對(duì)60份紫花苜蓿種質(zhì)材料進(jìn)行苗期對(duì)根腐病抗病性評(píng)價(jià)，通過(guò)計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)，并測(cè)定株高、地上生物量及地下生物量，得出12份耐病材料、34份感病材料、14份高感材料，無(wú)免疫和抗病材料，它們的發(fā)病率范圍是3.33%～100%，病情指數(shù)范圍為25.92～82.78;潘其龍等[16]用擬枝孢鐮刀菌接種測(cè)定30個(gè)紫花苜蓿品種苗期抗性，結(jié)果表明不同品種間抗性差異顯著，病情指數(shù)在30.67～64.67。關(guān)于苜蓿種苗期抗病性評(píng)價(jià)，郭玉霞等[17]將銳頂鐮刀菌接種于14個(gè)紫花苜蓿品種的種子上進(jìn)行種苗期對(duì)根腐病抗病性評(píng)價(jià)，通過(guò)測(cè)定相對(duì)根長(zhǎng)、苗高、發(fā)病率，并計(jì)算病情指數(shù)，得出1個(gè)品種抗病性最強(qiáng)、4個(gè)品種抗病性較強(qiáng)、5個(gè)品種抗病性較弱、1個(gè)品種抗病性最弱，它們的病情指數(shù)范圍為8.58～63.12;孔前前等[18]用150株鐮刀菌侵染‘中苜1號(hào)苜蓿種子，測(cè)定其發(fā)病率及病情指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)鐮刀菌的致病性。其中尖孢鐮刀菌的病情指數(shù)范圍為51.67～78.00。而苜蓿種子自身存在發(fā)芽率的問(wèn)題，本試驗(yàn)對(duì)苜蓿種子進(jìn)行催芽后接種尖孢鐮刀菌，避開(kāi)了苜蓿種子由于種子休眠、未受精、不完整、包衣過(guò)厚而影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性的問(wèn)題，降低了誤差。本試驗(yàn)對(duì)18個(gè)苜蓿品種芽期進(jìn)行尖孢鐮刀菌根腐病抗性評(píng)價(jià)，得出發(fā)病率范圍為66.67%～100%，病情指數(shù)變化范圍為25～68。這與辛寶寶等[15]、孔前前等[18]的試驗(yàn)雖然接種的菌種相同，但因接種時(shí)期和苜蓿品種的不同而導(dǎo)致病情指數(shù)存在較大差異。

4 結(jié)論

本研究從苜蓿根腐病病組織中分離得到病原菌，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與基于ITS序列的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致，確定所分離病原菌為尖孢鐮刀菌。18個(gè)苜蓿品種在芽期對(duì)其抗病性存在差異，由強(qiáng)到弱依次是‘龍牧801>‘斯貝德>‘SK3010>‘巨能-CR>‘肇東>‘DS310FY>‘WL168HQ>‘WL354HQ>‘TG4>‘WL319HQ>‘擎天柱>‘WL298HQ>‘龍牧806>‘北極星>‘皇后>‘北極熊>‘CW2000>‘敖漢。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）