中國不同地區(qū)草地貪夜蛾種群生物型分子特征分析

張磊 柳貝 姜玉英 劉杰 吳孔明 蕭玉濤

摘要 原產(chǎn)于美洲的草地貪夜蛾已入侵我國，對我國糧食生產(chǎn)安全構(gòu)成重大威脅。在美洲，該蟲的寄主類型、遷飛行為以及抗藥性等方面因群體分化而存在較大差異。本研究利用2個(gè)分子標(biāo)記對中國13?。ㄊ?、自治區(qū)）131個(gè)縣市的318份樣品進(jìn)行群體遺傳特征比較，基于線粒體COⅠ基因分析結(jié)果顯示96%以上為水稻型，玉米型比例不到4%，且中國樣品COⅠ序列特征與美國佛羅里達(dá)州種群有很高的一致性，而基于核基因組Tpi基因分析結(jié)果表明所有樣品單倍型特點(diǎn)均表現(xiàn)為玉米型。分析認(rèn)為，入侵我國的草地貪夜蛾群體很可能來自一個(gè)水稻型母本和玉米型父本雜交群體的后代，在長期的演化擴(kuò)散過程中，玉米型的核基因組占據(jù)了主導(dǎo)地位，從而成為一種特殊的玉米型。厘清入侵中國的草地貪夜蛾具體的遺傳特征屬性，對于風(fēng)險(xiǎn)評估、精準(zhǔn)監(jiān)測和科學(xué)防控具有重要指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 草地貪夜蛾; 群體演化; 水稻型; 玉米型; 雜交

中圖分類號： S 435.132

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019296

聯(lián)合國糧農(nóng)組織全球預(yù)警的重大害蟲草地貪夜蛾自2019年1月入侵中國以來，5個(gè)月時(shí)間內(nèi)已擴(kuò)散至18個(gè)省（市、自治區(qū)），大有席卷全國之勢，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大影響，國家糧食安全和生態(tài)安全受到嚴(yán)重威脅。

目前，草地貪夜蛾在我國主要為害玉米和甘蔗[1]，對其他作物的潛在危害造成的損失尚未確定?？紤]到草地貪夜蛾在美洲的為害特征，其寄主植物多達(dá)80余種，對玉米、水稻、高粱、大豆、小麥、棉花、牧草等均造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[23]，其危害的潛在風(fēng)險(xiǎn)巨大。草地貪夜蛾還存在寄主種類嗜好性差異，主要由于存在兩種不同的亞型，通常稱為水稻型和玉米型[45]，除此之外，遷飛行為[67]、農(nóng)藥抗性[89]以及對轉(zhuǎn)基因作物的抗性[1011]也與不同地理群體相關(guān)。目前我國發(fā)生草地貪夜蛾的省份都是水稻種植區(qū)，水稻是否會受到為害引起高度關(guān)注。因此，對入侵我國的草地貪夜蛾進(jìn)行群體遺傳特征鑒定顯得極為迫切。

分子標(biāo)記是鑒定草地貪夜蛾不同亞型的主要手段，其中來源于線粒體的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）以及位于Z染色體上的磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因（triose-phosphate isomerase，Tpi），是當(dāng)前最常用也是最成熟的標(biāo)記基因[1221]。不同亞型之間的雜交行為在實(shí)驗(yàn)室以及田間均證實(shí)存在[2223]，由于線粒體具有母系遺傳的特征，基于線粒體COⅠ基因的亞型鑒定具有一定的不確定性，而基于核基因組Z染色體的Tpi基因則表現(xiàn)出相對的穩(wěn)定性[2425]。然而，關(guān)于草地貪夜蛾復(fù)雜的群體遺傳動(dòng)態(tài)分析，這兩個(gè)標(biāo)記依然是當(dāng)前最合適的選擇。

本研究采集我國13個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）131個(gè)縣（市、區(qū)）的318份草地貪夜蛾樣品，利用COⅠ和Tpi兩個(gè)基因片段進(jìn)行分子檢測，鑒定具體生物型，并分析種群遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本次研究的樣品一共有318份，包含田間采集的幼蟲和性誘的成蟲。采集地點(diǎn)包括云南、廣西、廣東、四川、貴州、海南、湖南、福建、浙江、江西、上海、重慶、湖北13個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）131個(gè)縣（市、區(qū)），樣品采集時(shí)間為2019年3月11日至6月11日，寄主植物主要為玉米，少數(shù)樣品取于蘇丹草或水稻。幼蟲樣品收到后用75%乙醇浸泡30 min，隨后常溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，成蟲樣品保持干燥，常溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。各縣市具體樣品信息見表1。

1.2 PCR擴(kuò)增及測序

成蟲或幼蟲單頭蟲體用液氮研磨成粉后，采用Multisource Genomic DNA Miniprep Kit試劑盒進(jìn)行DNA提取，DNA經(jīng)過1%瓊脂糖電泳檢測，使用NanoDrop ND-2000儀器測定濃度。根據(jù)已發(fā)表引物和PCR擴(kuò)增方法[26]，分別對COⅠ基因和Tpi基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，使用1%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用BioEdit軟件查看測序序列峰圖，去除兩端低質(zhì)量序列，區(qū)分雜合位點(diǎn)，獲得準(zhǔn)確的基因片段序列。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載全球各代表性地區(qū)草地貪夜蛾COⅠ基因核酸序列。所有序列采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行比對，刪除兩端不對齊序列，選取Kimura-2參數(shù)模型，以鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗(yàn)值（bootstrap）由1 000次重復(fù)檢驗(yàn)獲得。針對玉米型和水稻型Tpi基因序列單倍型差異特點(diǎn)[25]，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行特異位點(diǎn)比對分析。

2 結(jié)果與分析

通過對COⅠ基因序列進(jìn)行比對分析，從318份樣品中鑒定出水稻型和玉米型兩種基因型，其中水稻型306份，占96.2%，玉米型不到4%（表1）?？梢娨訡OⅠ基因作為分子標(biāo)記，水稻型在群體數(shù)量上占絕對主導(dǎo)。

將本研究測定的COⅠ基因序列與NCBI公布的北美美國、南美巴西、非洲南非、亞洲印度等的草地貪夜蛾的COⅠ序列進(jìn)行比對，以棉鈴蟲Helicoverpa armigera COⅠ序列作為外群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。由于我國所有樣品中屬于同一基因型的樣品序列高度一致，我們僅各選取1條序列（strain 1和strain 2）進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，中國樣品strain 2的COⅠ序列與印度、南非、美國佛羅里達(dá)種群的序列一致，與巴西以及美國的另一種群的序列有一定差別。雖然整個(gè)分支均為水稻型，但是從進(jìn)化樹也可看出，美洲不同地域種群的序列之間存在一定程度變異。在玉米型分支中，中國樣品strain 1與南非以及美國佛羅里達(dá)種群的序列一致。與水稻型分支類似，來自美國不同地區(qū)的玉米型的COⅠ序列也表現(xiàn)出一定的差異。

我們比對所有樣品Tpi基因序列，針對水稻型和玉米型10個(gè)差異單倍型位點(diǎn)進(jìn)行分析，除了部分樣品在2個(gè)位點(diǎn)顯示為雜合外（圖2），其余樣品均只顯示一種基因型，并且均與玉米型單倍型特征相符合，該結(jié)果表明基于Tpi基因的序列分析顯示所有樣品均為玉米型。

3 討論

草地貪夜蛾在原產(chǎn)地美洲由于取食寄主植物的不同分化出玉米型和水稻型兩種亞型，玉米型偏向取食玉米、甘蔗、高粱、谷子、棉花、大豆、花生等，而水稻型偏向取食水稻、各種牧草等。兩種亞型在形態(tài)學(xué)上完全無法區(qū)分[5， 27]，通過COⅠ和Tpi等分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定一直是主流方法，能夠根據(jù)不同亞型單倍型特點(diǎn)將絕大多數(shù)水稻型和玉米型有效區(qū)分[1214， 2425]。此外，不同亞型在長期進(jìn)化過程中，形成了一些特定的群體，包括對農(nóng)藥的抗性群體以及針對轉(zhuǎn)基因作物的抗性群體，這些群體的鑒定也多依賴于分子輔助檢測手段[9， 11]。

在前期工作中，我們利用COⅠ和Tpi兩種分子標(biāo)記聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)入侵我國云南的82份草地貪夜蛾幼蟲樣品具有完全一致的基因型，并且通過Tpi基因單倍型位點(diǎn)比對分析鑒定為玉米型[26]。在本研究中，我們擴(kuò)大了樣品采集地區(qū)，大大增加了樣本數(shù)量，不僅包含了各齡期幼蟲和成蟲，還覆蓋了不同類型的寄主植物，運(yùn)用相同的方法對入侵我國的草地貪夜蛾群體遺傳特征進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究。分析結(jié)果表明入侵我國的草地貪夜蛾具有兩種COⅠ基因型，而基于Tpi基因的結(jié)果顯示均為玉米型，僅僅部分樣品在2個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出雜合現(xiàn)象，使用兩種分子標(biāo)記鑒定出現(xiàn)了不一致的結(jié)果。由于線粒體屬于母系遺傳，后代僅能遺傳母本的線粒體DNA，且兩種亞型之間并不存在絕對的生殖隔離，雌性水稻型和雄性玉米型的交配行為在實(shí)驗(yàn)室和田間均被證實(shí)存在[23]，因此分析認(rèn)為，本研究中的不一致是由于水稻型母本和玉米型父本雜交產(chǎn)生，導(dǎo)致后代獲得了水稻型線粒體的COⅠ基因序列，但是核基因組在長期的繁衍擴(kuò)散過程中更多地保留了玉米型的背景基因組，從而演化成特殊的玉米型。本研究中占主導(dǎo)的96%的樣品為一個(gè)雜交型群體的后代，由水稻型母本和玉米型父本雜交后代演化而來。由于在我國所有樣品中均未檢測出完全符合水稻型Tpi基因單倍型，因此推測該雜交發(fā)生在入侵我國、甚至是入侵非洲之前。

通過構(gòu)建基于COⅠ基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，我們發(fā)現(xiàn)入侵我國的草地貪夜蛾與南非、印度以及美國佛羅里達(dá)的草地貪夜蛾聚為一支，序列比對也表明具有完全一樣的基因型。在美洲，根據(jù)COⅠ基因單倍型頻率可以將玉米型草地貪夜蛾分為佛羅里達(dá)（FL-type）和德克薩斯（TX-type）兩個(gè)地理型亞群，其中TX-type廣泛分布在南美、墨西哥和美國大部分地區(qū)，F(xiàn)L-type限于佛羅里達(dá)、加勒比海地區(qū)和美國東海岸[2830]。已有研究報(bào)道顯示，入侵非洲的草地貪夜蛾群體很可能是通過貿(mào)易往來被帶入非洲的一小部分群體繁衍擴(kuò)散形成的[2]。由于在美洲已有少量關(guān)于雜交型群體后代的報(bào)道[22]，因此極有可能是來自美國佛羅里達(dá)的雜交演化群體后代傳入非洲。從進(jìn)化樹可以看出，中國草地貪夜蛾與非洲草地貪夜蛾COⅠ基因序列完全一致，且主導(dǎo)型比例相同[15，31]，因此我們推斷草地貪夜蛾入侵非洲之后，不斷擴(kuò)散，隨后進(jìn)入西亞，持續(xù)往東擴(kuò)散至東南亞地區(qū)，最后通過中緬邊境侵入我國，呈現(xiàn)擴(kuò)散暴發(fā)態(tài)勢。

雖然目前有部分研究報(bào)道水稻型在非洲和亞洲也存在，但是僅僅是基于COⅠ單基因或多個(gè)線粒體來源的基因鑒定[15，17]，對于Tpi基因的分析也是根據(jù)個(gè)別變異位點(diǎn)的判斷[16]，基于PCR的一代測序也可能會由于擴(kuò)增或測序誤差造成堿基差異。在本研究中，部分樣品Tpi基因也存在2個(gè)位點(diǎn)的雜合（圖2），由于草地貪夜蛾性別決定屬于ZW型，Tpi基因位于Z染色體，因此可能會因?yàn)榇菩裕╖W）或者雄性（ZZ）個(gè)體性別差異造成雜合。

通常情況下，背景單一的小種群長期的近交會經(jīng)歷種群瓶頸效應(yīng)，容易造成遺傳衰退[32]。而侵入我國的草地貪夜蛾的祖先具有雜交背景，后代理論上可能具有某種程度的雜交優(yōu)勢，顯示出更強(qiáng)的適應(yīng)性;也可能由于雜交而產(chǎn)生一定的適合度代價(jià)，導(dǎo)致自身抵抗能力下降。值得注意的是，侵入我國的草地貪夜蛾在取食行為以及為害特征上可能與傳統(tǒng)的玉米型有所差異，包括農(nóng)藥抗性和對轉(zhuǎn)基因作物的抗性遺傳特征會相應(yīng)改變，因此僅僅通過連鎖分子標(biāo)記檢測可能造成一定偏差，還需要結(jié)合更加完整的生物測定進(jìn)行判斷。對于這一新的玉米型草地貪夜蛾，在防控措施上可能要更加的謹(jǐn)慎。鑒于入侵群體祖先經(jīng)歷過雜交，理論上存在進(jìn)化出水稻型的可能性，還需要進(jìn)一步基因組測序的數(shù)據(jù)來論證，因此需要對水稻作物進(jìn)行更加嚴(yán)密的監(jiān)控。

目前我國發(fā)現(xiàn)受害作物主要有玉米，部分省份有甘蔗、高粱和少量的谷子、花生，均屬于玉米型寄主植物。四川省合江縣植保站4月30日在水稻秧苗捕捉到幾頭高齡草地貪夜蛾幼蟲（COⅠ基因鑒定為草地貪夜蛾，但是Tpi基因無法擴(kuò)增），湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)李有志教授5月13日在湖南省岳陽市平江縣稻田發(fā)現(xiàn)在3 m2的范圍內(nèi)有17頭4齡期幼蟲，并且都在稻株上進(jìn)行取食，后來當(dāng)?shù)刂脖２块T普查未在稻田見有為害。推測為低齡幼蟲吐絲擴(kuò)散至水稻植株上，或遷入成蟲在無法搜尋到最適寄主玉米的情況下，被迫選擇水稻產(chǎn)卵，因此應(yīng)是環(huán)境脅迫造成的偶然事件。

總的來說，目前我國發(fā)生的草地貪夜蛾存在兩種線粒體COⅠ基因型，且比例差異懸殊。然而兩種基因型所代表的群體之間是否有雜交，在雌雄交配選擇上是否有偏好性，需要更進(jìn)一步的研究。此外，本研究中有多份樣品僅能得到COⅠ擴(kuò)增片段，而采用Tpi引物無法擴(kuò)增出有效片段，可能是由于樣品DNA質(zhì)量較差，也不排除具有更加復(fù)雜的基因組背景特征，需要采用全基因組分析手段，選取更多的位點(diǎn)，針對水稻型和玉米型兩種亞型基因組差異特征[33]，進(jìn)行具體的測序分析和位點(diǎn)比對，更加深入地挖掘入侵我國的草地貪夜蛾的遺傳特征，為其防控提供更加準(zhǔn)確的信息。我國當(dāng)前對于草地貪夜蛾的群體遺傳研究有限，亟待更多的數(shù)據(jù)支持。還應(yīng)密切跟蹤非洲、亞洲等國家水稻型擴(kuò)散動(dòng)向，提高我國防范該類型草地貪夜蛾的主動(dòng)性。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）