滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)脾陰虛大鼠空腸組織黏蛋白表達(dá)的影響

侯圣林 戰(zhàn)麗彬 孫曉霞

摘要：目的? 觀察滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)脾陰虛大鼠空腸組織黏蛋白（MUC）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法? 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和滋補(bǔ)脾陰方藥組。采用復(fù)合方法建立脾陰虛證動(dòng)物模型，連續(xù)38 d，滋補(bǔ)脾陰方藥組于造模第25～38日予滋補(bǔ)脾陰方藥藥液灌胃，正常對(duì)照組和模型組予生理鹽水灌胃。免疫組化觀察大鼠空腸組織MUC的表達(dá)。結(jié)果? 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠空腸組織MUC2蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，MUC3和MUC5AC蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠MUC2蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，MUC3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.001），MUC5AC蛋白表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)。結(jié)論? 滋補(bǔ)脾陰方藥可改善脾陰虛模型大鼠MUC的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：脾陰虛;滋補(bǔ)脾陰方藥;黏蛋白;空腸;大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）08-0051-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.011????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Zibu Piyin Recipe on MUC expression in rats with spleen-yin deficiency; To discuss the relevant mechanism of action. Methods The rats were randomly divided into normal control group， model group and Zibu Piyin Recipe group. The animal model of spleen-yin deficiency syndrome was established by compound method for 38 days. Zibu Piyin Recipe group was given Zibu Piyin Recipe for gavage during d25-d38 of modeling， the normal control group and the model group were given nornal saline for gavage. The expression of MUC of colon tissues was observed by immunohistochemistry. Results Compared with the normal control group， the expression of MUC2 protein in the model group was has a downward trend， and the expressions of MUC3 and MUC5AC protein increased （P<0.05）. Compared with the model group， the expression of MUC2 protein in Zibu Piyin Recipe group was has an upward trend. Expression of MUC3 protein was significantly decreased （P<0.001）， and expression of MUC5AC protein was has a downward trend. Conclusion Zibu Piyin Recipe can improve the MUC expression of spleen-yin deficiency model rats.

Keywords： spleen-yin deficiency syndrome; Zibu Piyin Recipe; mucin; jejunum; rats

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，脾的功能為運(yùn)化水谷、輸布水液和精微物質(zhì)，又具有統(tǒng)攝血液的作用，故“脾為后天之本”。脾陰虛的病理變化表現(xiàn)在運(yùn)化失司、營(yíng)陰不足、陰虛內(nèi)熱等。脾的生理功能會(huì)直接影響機(jī)體防御疾病的能力，因而有“脾主為衛(wèi)，脾虛則百病內(nèi)生”的說法[1]。黏蛋白（mucin，MUC）廣泛存在于消化道，維持黏液保護(hù)層厚度及膠體形態(tài)，潤(rùn)滑腸道，在胃腸黏膜的防御和修復(fù)過程中扮演著重要角色。胃腸黏膜的防御屏障機(jī)制與中醫(yī)的“脾主為衛(wèi)”有著相同生理病理基礎(chǔ)。這種聯(lián)系表明胃腸黏膜的防御功能減弱可能與脾胃生理功能減退有關(guān)。提示脾胃的防衛(wèi)功能不僅與全身免疫功能有關(guān)，而且與胃腸黏膜本身的防御屏障功能有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)脾陰虛大鼠空腸MUC2、MUC3和MUC5AC蛋白表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

健康Wistar雄性大鼠18只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫18～23 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，明暗12 h交替。

1.2? 藥物

滋補(bǔ)脾陰方藥（紅參30 g，蓮肉20 g，山藥15 g，茯苓15 g，白芍15 g，白扁豆15 g，丹參12 g，石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，檀香4.5 g，橘紅9 g，炙甘草9 g），飲片購(gòu)于大連醫(yī)藥集團(tuán)藥材公司，常規(guī)水煎，每毫升藥液含原藥材3.29 g，過濾后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。傷陰藥（制附子、吳茱萸、肉桂?∶1∶1混合），飲片購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，常規(guī)水煎，每毫升藥液含原藥材1 g，過濾后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 主要試劑與儀器

MUC（MUC2、MUC3、MUC5AC）免疫組化試劑盒（美國(guó)Abcam公司）。AC8洗板機(jī)（美國(guó)Thermo Labsystem公司），ASP300S全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司），Image Pro Plus 5.0.2免疫組化圖像分析軟件。

1.4? 分組、造模及給藥

18只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、脾虛模型組。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由攝食飲水。采用復(fù)合因素（飲食不節(jié)、勞倦過度與耗傷陰液等）方法建立脾陰虛模型[2]。脾氣虛模型階段：采用飲食不節(jié)與力竭游泳相結(jié)合的方式，即先飽食1 d，再禁食2 d，3 d為1個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水;每日1次，水溫保持22 ℃游泳至力竭，連續(xù)14 d。脾陰虛模型階段：第15日，將脾氣虛證造模成功大鼠每日增加傷陰藥藥液1 mL/100 g灌胃。正常對(duì)照組予等體積生理鹽水灌胃。滋補(bǔ)脾陰給藥階段：第25～38日將脾陰虛模型組分為模型組和滋補(bǔ)脾陰方藥組，其中滋補(bǔ)脾陰方藥組每日予滋補(bǔ)脾陰方藥藥液1 mL/100 g灌胃，正常對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。每日詳細(xì)記錄大鼠體質(zhì)量、肛溫、飲水量及進(jìn)食量，并觀察大鼠糞便及毛發(fā)色澤等。

1.5? 模型評(píng)估

參考《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[3]及《中醫(yī)新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[4]。在脾氣虛造模狀態(tài)下，大鼠出現(xiàn)食少、消瘦、神疲乏力、毛色枯槁無光澤，便溏或軟，并且游泳耐力下降，表明脾氣虛模型建立成功。脾陰虛造模狀態(tài)下，大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、易暴躁、易激怒、時(shí)有咬斗、肛溫升高、糞便干燥、毛發(fā)枯槁無光澤、進(jìn)食量時(shí)增時(shí)減和飲水量增多等現(xiàn)象，表明脾陰虛模型建立成功。

1.6? 標(biāo)本制備

末次給藥后，2%戊巴比妥鈉麻醉，大鼠腹主動(dòng)脈取血，冰上迅速摘取空腸組織，分成50～100 mg小塊，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。

1.7? 免疫組化檢測(cè)空腸組織黏蛋白表達(dá)

按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗2次×5 min，抗原修復(fù)。用蒸餾水或PBS配制新鮮3%H2O2，室溫封閉10 min，蒸餾水洗1次。PBS沖洗5 min，滴加5%牛奶封閉液，室溫10 min。甩去多余液體，滴加一抗，4 ℃過夜（過夜后37 ℃復(fù)溫45 min）。PBS洗2次×5 min，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min。PBS洗2次×5 min，滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉菌抗生物素溶液，37 ℃孵育20 min。PBS洗2次×5 min，DAB顯色3～10 min，鏡下觀察染色程度。蒸餾水沖洗終止染色，蘇木素復(fù)染2 min。分化后透明、封片，待鏡檢。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，大鼠空腸組織棕黃色區(qū)域?yàn)镸UC陽性表達(dá)（見圖1～圖3）。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠MUC2蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，MUC3和MUC5AC蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠MUC2蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，MUC3蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），MUC5AC蛋白表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)。見表1。

3? 討論

脾為“倉(cāng)廩之官”“后天之本”，機(jī)體很多疾病的產(chǎn)生都與脾虛有一定聯(lián)系。脾為五臟六腑之本，脾失健運(yùn)，不能運(yùn)化水谷精微，提示機(jī)體處于脾虛狀態(tài)時(shí)，機(jī)體胃腸黏膜防御功能下降?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，脾是以消化系統(tǒng)為基礎(chǔ)的，包括能量代謝與水液代謝，并與血液、內(nèi)分泌、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)等有著密切聯(lián)系的一個(gè)醫(yī)學(xué)概念，是一個(gè)多系統(tǒng)、多器官的功能單位。有研究者認(rèn)為，脾虛涵蓋了機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)以及系統(tǒng)的多個(gè)功能的異常，其主要特征是消化系統(tǒng)形態(tài)與功能的異常[5]。脾為太陰，乃三陰之長(zhǎng)，脾陰是指藏于脾中的由水谷精微所化生的營(yíng)血津液等精微物質(zhì)，是人體陰液的一部分，也是脾臟功能活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。脾陰生理功能主要表現(xiàn)在運(yùn)化濡養(yǎng)、統(tǒng)攝血液和制約陽熱等方面，脾陰病理表現(xiàn)主要包括運(yùn)化失司、陰虛內(nèi)熱、營(yíng)陰不足等。其主要癥狀為：食少腹脹，食后尤甚，大便溏薄或秘結(jié)、溏結(jié)不調(diào)，口干舌燥，形體消瘦，面色無華，倦怠乏力，手足心熱，舌紅少津，苔少或無，脈細(xì)無力[6]。滋補(bǔ)脾陰方藥是戰(zhàn)麗彬教授在《不居集》資成湯基礎(chǔ)上結(jié)合自身多年臨床實(shí)踐化裁而成[7]，方中人參補(bǔ)益脾氣以助脾陰，山藥培補(bǔ)脾元，白扁豆、茯神滋陰補(bǔ)脾，白芍柔肝健脾，佐以蓮肉、丹參交通心腎。全方以培補(bǔ)后天、滋補(bǔ)脾陰為立方原則，所含藥物具有質(zhì)地濡潤(rùn)、生津化液、補(bǔ)而不燥、滋而不膩、守中化陰、不礙升運(yùn)的特點(diǎn)。

MUC主要存在于胃腸道、乳腺、胰腺上皮細(xì)胞中，是由杯狀上皮細(xì)胞合成分泌的大分子量糖蛋白，至今已發(fā)現(xiàn)21種MU。根據(jù)MUC不同的功能或特點(diǎn)可分為不同種類，依據(jù)其生理學(xué)特點(diǎn)可分為膜結(jié)合型、分泌型、可溶性MUC。這3種MUC主要區(qū)別在于是否具有跨膜區(qū)。膜結(jié)合型MUC主要分布在細(xì)胞表面或胃腸上皮黏液中，MUC3存在于跨膜區(qū)、胞質(zhì)尾區(qū)和廣泛的胞外區(qū)。分泌型MUC多由凝膠形式存在，MUC2、MUC5AC形成低聚物結(jié)構(gòu)?？扇苄訫UC屬非凝膠形式MUC。MUC具有多種功能，結(jié)構(gòu)不同所具有的功能也不盡相同。MUC2主要存在結(jié)腸、空腸中，是腸道黏液的組成部分。MUC3是由小腸、結(jié)腸絨毛上皮細(xì)胞分泌的，是一種跨膜MUC。MUC5AC主要表達(dá)于胃黏膜，目前研究發(fā)現(xiàn)在一些病理情況下也會(huì)表達(dá)于腸黏膜[8]。MUC對(duì)腸黏膜上皮具有保護(hù)作用，在腸道黏膜防御中發(fā)揮積極作用，同時(shí)，MUC分泌本身還可起到潤(rùn)滑作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠較正常對(duì)照組空腸組織MUC2蛋白表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，滋補(bǔ)脾陰方藥組空腸組織MUC2蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì);模型組大鼠空腸組織MUC3和MUC5AC蛋白均有明顯表達(dá)，滋補(bǔ)脾陰方藥組空腸組織MUC3蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，MUC5AC蛋白表達(dá)也有下調(diào)趨勢(shì)。

綜上所述，脾陰虛狀態(tài)下，空腸黏膜分泌MUC2出現(xiàn)下降趨勢(shì)，空腸黏膜分泌MUC3、MUC5AC增加，經(jīng)滋補(bǔ)脾陰方藥治療后，MUC2分泌又出現(xiàn)增加趨勢(shì)，MUC3表達(dá)明顯降低，MUC5AC表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。這提示滋補(bǔ)脾陰方藥可能有改善脾陰虛大鼠空腸黏膜的屏障作用。

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（收稿日期：2018-12-22）

（修回日期：2019-01-15;編輯：華強(qiáng)）