響應(yīng)面法優(yōu)化草莓酒釀造工藝

孫曉璐，王明躍，張 源

（1.阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系，安徽 阜陽 236000；2.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

發(fā)酵果酒的本質(zhì)上是用釀酒酵母，以天然酵母為輔的微生物代謝的過程，經(jīng)測定發(fā)酵果酒中含有豐富的抗氧化作用成分，這些抗氧化物質(zhì)與維生素相比，具有更強的抗氧化活性[1]。其中罕有的多酚類成分具有明顯的抗氧化性能，例如抗氧化酶、維生素E等物質(zhì)。草莓果肉中富含豐富維生素C不僅能消除細胞間的松弛，讓肌膚處于緊張狀態(tài)，從而使皮膚緊致，而且對腦和智力發(fā)酵有重要影響[2]。目前，江淮流域草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，為有效地緩解產(chǎn)量過剩的問題，不少學(xué)者對草莓進行了深加工的探究，其中張源等對草莓酒的自然發(fā)酵菌種進行了深入研究，并分離出大量利于草莓酒發(fā)酵的天然菌株[3]已經(jīng)應(yīng)用在草莓酒釀造的產(chǎn)業(yè)中。同時具有調(diào)節(jié)新陳代謝、美容養(yǎng)顏、抗衰老等作用[4]，近年來，劉興艷等對草莓酒的發(fā)酵工藝、澄清工藝等進行了探索，并取得一定成效，為草莓酒的發(fā)酵優(yōu)化了工藝[5]。通過草莓酒釀造過程中的初始糖度、酵母菌接種量和發(fā)酵時間幾項關(guān)鍵指標做了單因素試驗，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化了試驗條件[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓鮮果，2019年3月采于阜陽市聞集鎮(zhèn)草莓種植基地；白砂糖、安琪釀酒酵母、復(fù)合果膠酶（酶活力100 000 U/g）均為市售；硅藻土、二氧化硫、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂等其它生化試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-100F生化培養(yǎng)箱：上海越特科技有限公司；LB10T糖度計：速為科技公司；電子天平：深圳市華超高科；發(fā)酵罐：帝伯仕10 L；無菌取樣管，移液器，紗布等。

1.3 試驗方法

1.3.1 草莓酒釀酒操作過程

挑選出無破損的草莓、成熟度高，去蒂后，用水清洗、晾干。榨汁后的草莓果漿在28℃條件下，加入果膠酶酶解，根據(jù)實驗設(shè)計進行調(diào)整，在通過巴氏滅菌10 min[8]。冷卻至常溫后，進行恒溫發(fā)酵，發(fā)酵天數(shù)為10 d，發(fā)酵終止后，進行過濾澄清，放置到5℃條件下進行陳釀15 d[9]。

1.3.2 方法測定

糖度折光儀：測定初始糖度、殘?zhí)呛?。參照農(nóng)業(yè)部標準NY/T1508-2017《綠色食品果酒》進行感官評定，并根據(jù)草莓酒的特性，制定其感官評分標準[10]。由5名專業(yè)人員組成評定小組，對果酒的外觀，風味、特性進行觀察和品嘗并打分[11]。

1.3.3 草莓酒發(fā)酵單因素試驗

將草莓果漿分成三組，在第一組中確定相同的初始糖度，進行相同的發(fā)酵時間，酵母接種量分別設(shè)定為 0.05%、0.75%、0.1%、0.15%、0.2%的水平下進行取樣測定；第二組設(shè)置相同的發(fā)酵時間，選擇相同的釀酒酵母接種量，初始糖量分別為0、5%、12.5%、15%、20%、25%的條件下進行發(fā)酵；第三組實驗以相同的初始糖度和釀酒酵母的接種量，分別完成發(fā)酵液發(fā)酵時間為72 h、120 h、168 h、216 h、240 h的相關(guān)指標測定，最終確定成品果酒的感官指標。

1.3.4 響應(yīng)面試驗進行草莓酒發(fā)酵條件的優(yōu)化

所有數(shù)據(jù)進行整理及作圖，試驗數(shù)據(jù)用Design expert 8.0統(tǒng)計軟件進行響應(yīng)面法分析，進行并差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

設(shè)定初始糖度（X1）、釀酒酵母接種量（X2）和發(fā)酵時間（X3）3個因素分別為自變量，以感官評分(Y)為響應(yīng)值，從而確定草莓酒的最佳工藝條件，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對草莓酒發(fā)酵結(jié)果的影響

2.1.1 酵母菌接種量對草莓酒發(fā)酵的影響

在草莓酒的發(fā)酵過程中，除草莓本身攜帶的天然酵母外，額外添加的釀酒酵母將對草莓酒的順利發(fā)酵起到一定作用，對草莓酒的口感、風味物質(zhì)起著重要影響[12]。本實驗分別以釀酒酵母接種量為 0.05%、0.75%、0.1%、0.15%、0.2%5個水平做單因素試驗，按照1.3.1工藝來進行草莓酒的后續(xù)處理，選出比較適合發(fā)酵的釀酒酵母接種量。

由表2可以看出，在釀酒酵母接種量為0.05%時，發(fā)酵液中殘?zhí)呛孔罡邽?.5 g/L，口感中帶有甜味，說明在過程中沒有將糖分進行徹底發(fā)酵，不能作為干酒來飲用，為甜味果酒[13]；當釀酒酵母接種量為0.15%時，殘?zhí)呛繛?.3 g/L，但是感官評分達到最高，口感最佳，聞之酒香突出，果香濃郁，酒體通透，呈濃郁的紅色；繼續(xù)提高酵母菌的接種量達到0.2%時，殘?zhí)呛孔钌?，在發(fā)酵初期發(fā)酵最為迅速，泡沫產(chǎn)生較多，后期程度急劇下降，發(fā)酵最為徹底，但是感官評分較低，由此推測由于釀酒添加量過大，釀酒酵母繁殖迅速，不利于釀酒酵母在后期的持續(xù)發(fā)酵，導(dǎo)致酒體風味欠佳[14]。因此，酵母的接種量為0.15%時最佳。

表2 不同酵母接種量對酒品質(zhì)的影響

2.1.2 初始糖度對草莓酒發(fā)酵結(jié)果的影響

草莓果漿中含有天然葡萄糖、蔗糖、果糖等多種糖分，在進行草莓酒的釀造過程中，釀酒利用糖分轉(zhuǎn)化成為酒精，酒精度的高低將對草莓酒的風味起著重要作用[15]，本實驗分別以添加糖量為0、5%、15%、20%、25%5個水平做單因素試驗，按照1.3.1工藝來進行草莓酒的后續(xù)處理，選出比較適合發(fā)酵的初始糖度。

由表3可以看出，當添加糖量為0時，草莓酒中殘?zhí)呛繛?.5 g/L，說明在草莓果漿中本身含有少量的糖分，這也是能讓酒精度達到1.8%vol的原因，但是感官評分最低，并且能聞到異味，這可能是在草莓酒發(fā)酵過程中，糖度較低，產(chǎn)生的酒精含量就少，防腐效果較差，其他雜菌容易滋生，產(chǎn)生的邪雜味，導(dǎo)致口感最差[16]。當糖量添加到為20%時，殘?zhí)呛勘容^高達到9 g/L，但是酒精度最高為6.0%vol，感官評分達到85分，酒體清亮，色澤鮮艷，口感較好。

表3 不同初始糖量對酒品質(zhì)的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對草莓酒發(fā)酵結(jié)果的影響

草莓酒的發(fā)酵過程很快，在合適的溫度下，具備發(fā)酵條件時，發(fā)酵最快可在72 h完成，但是隨著時間的延長，草莓酒開始進入后發(fā)酵時期，在一段時間內(nèi)，代謝產(chǎn)品中的其他副產(chǎn)物也隨之產(chǎn)生，這些產(chǎn)品中含有酒體中很多風味物質(zhì)，有高級醇、酯等復(fù)雜成分產(chǎn)生，這也是發(fā)酵酒的香味來源[17]。本實驗分別以發(fā)酵 72 h、120 h、168 h、216 h、240 h 5個水平做單因素試驗，按照1.3.1工藝來進行草莓酒的后續(xù)處理，選出比較適合發(fā)酵的時間。

表4可以看出，當添加糖量為72 h時，草莓酒中殘?zhí)呛繛?.5 g/L，說明在初期，釀酒酵母就開始繁殖并發(fā)酵得到代謝產(chǎn)品，但是酒精度不高為3.0%vol，并且酒體口感較差，感官評分為70分，目測酒體較為渾濁，有明顯顆粒物存在[18]。當發(fā)酵時間延長到216 h時，感官評分最高為85分，繼續(xù)發(fā)酵至240 h時，酒精度雖然達到比較高的值為6.2%vol，但是口感較216 h時較差，出現(xiàn)了雜味，發(fā)酵液上層出現(xiàn)了白色泡沫，隨著發(fā)酵時間的延長，代謝副產(chǎn)物逐漸增加，使酒體中風味物質(zhì)發(fā)生了變化，從而影響酒體的口感[19]。因此，確定了發(fā)酵最佳時間為216 h。

表4 不同發(fā)酵時間對酒品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化草莓酒發(fā)酵條件

根據(jù)1.3.3中提供的組合設(shè)計原理，設(shè)計響應(yīng)面試驗因素與水平試驗組合。

通過析因?qū)嶒灪椭行脑囼?，以析因點為自變量取值在初始糖度X1、接種量X2和發(fā)酵時間X3所構(gòu)成的交互形式，取中心點分別進行3次實驗，用來估計實驗過程中的誤差。進行回歸擬合，得二次回歸模型為：

由響應(yīng)面分析得出可決系數(shù)R2=0.929 7，方程擬合效果好，誤差小，可以用來預(yù)測果酒的感官評分。其中X1、X3、X1X3、X12的影響極顯著（P＜0.05），說明對感官評分影響較大；發(fā)酵時間X3和初始糖度X1對應(yīng)的平方項X12中P＜0.05對酒精度影響是比較顯著的，其中X2X3對感官評分影響效果由于P＞0.05，影響不明顯。3個因素分別對草莓酒感官評分的影響為初始糖度大于發(fā)酵時間，發(fā)酵時間的影響大于酵母接種量，因此，初始糖度對草莓酒的釀造將起著關(guān)鍵性的作用。

由圖1可以看出，在所選范圍內(nèi)是存在極點的，其中發(fā)酵時間和初始糖度的響應(yīng)面坡度比較陡峭、等高線偏橢圓，說明發(fā)酵時間和初始糖度之間的交互作用顯著，對結(jié)果影響較大。通過響應(yīng)面分析軟件得出草莓酒釀造最優(yōu)工藝：初始糖度25%，接種量0.75%發(fā)酵時間為240 h，感官評分預(yù)測值為90.625。

依照響應(yīng)面分析給出的實驗條件，本實驗組以此條件進行了發(fā)酵實驗，感官評分為88～92之間，平均值為89.2，與預(yù)測值比較接近，并且酒體的澄清度比較高，色澤通透鮮艷，酒體果香味明顯。釀造果酒的酒體透明度對感官評分起著重要作用[20]。通過響應(yīng)面分析方法能將草莓酒發(fā)酵過程中諸多工藝進行合理優(yōu)化，通過利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了蜜柚桂圓發(fā)酵果酒釀造工藝[21]得出最佳釀造工藝；在通過對草莓酒發(fā)酵菌種的篩選及工藝優(yōu)化的過程中得出結(jié)論酵母菌種、發(fā)酵溫度、菌種添加量的正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝得出果酒感官評分為92.5，酒精度達到12.5%vol[22]。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，在草莓酒的發(fā)酵過程中，菌種添加量、發(fā)酵時間、釀酒酵母的種類及用量對草莓酒的發(fā)酵都有顯著的影響。

圖1 初始糖度、酵母接種量、發(fā)酵時間相互作用對草莓酒的影響

3 小結(jié)

依照響應(yīng)面分析給出的實驗條件，本實驗組以此條件進行了發(fā)酵實驗，感官評分為88～92之間，平均值為89.2，與預(yù)測值比較接近，并且酒體的澄清度比較高，色澤通透鮮艷，酒體果香味明顯。在草莓酒的發(fā)酵過程中，菌種添加量、發(fā)酵時間、釀酒酵母的種類及用量對草莓酒的發(fā)酵都有顯著的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化草莓酒的發(fā)酵條件，得出的相關(guān)交互作用的最優(yōu)條件是可行的，具有實際應(yīng)用的價值。