飼料中添加肉桂醛和芽孢桿菌對(duì)半滑舌鰨腸道結(jié)構(gòu)的影響

蔣溥，王競(jìng)?cè)?，劉桐，謝體彪，朱鵬錦，王慶奎，王洋

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）因生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)滑嫩、味道鮮美而深受消費(fèi)者喜愛。目前，半滑舌鰨的養(yǎng)殖以工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖為主，但因養(yǎng)殖密度大、生態(tài)不平衡，魚體抗病力低，極易發(fā)生病害。肉桂醛（3-苯基丙稀醛）具有防腐殺菌[1-2]、抗炎[3]、抗癌[4]等作用，作為抗生素替代物，已廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖[5]。近年來(lái)，肉桂醛在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用也取得了理想效果。前期研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加肉桂醛能顯著提高半滑舌鰨的免疫力和抗病能力，然而肉桂醛在抑制病原微生物的同時(shí)[6]，也會(huì)降低益生菌的數(shù)量[7]，因此可能影響水產(chǎn)動(dòng)物的腸道菌群平衡。為此，團(tuán)隊(duì)前期從益生芽孢桿菌中篩選出一株高產(chǎn)水解酶，且對(duì)低濃度肉桂醛具有一定抗性的益生菌，可與肉桂醛聯(lián)合應(yīng)用與水產(chǎn)養(yǎng)殖。芽孢桿菌能夠顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料中碳水化合物[8]、蛋白質(zhì)和脂肪[9]的利用率，水產(chǎn)品生長(zhǎng)性能[10]，并改善水產(chǎn)動(dòng)物的腸道結(jié)構(gòu)[11]。在前期研究中，團(tuán)隊(duì)通過(guò)養(yǎng)殖試驗(yàn)證明了芽孢桿菌與肉桂醛聯(lián)合使用能顯著提高半滑舌鰨的生長(zhǎng)性能和飼料利用率。然而，二者共同使用時(shí)對(duì)腸道結(jié)構(gòu)的影響還未闡明。

基于此，本研究考察肉桂醛和芽孢桿菌聯(lián)合投喂半滑舌鰨60天后對(duì)半滑舌鰨腸道結(jié)構(gòu)的影響，為芽孢桿菌與肉桂醛在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 半滑舌鰨的養(yǎng)殖與分組

60尾體表無(wú)傷、體質(zhì)健壯、規(guī)格差別較小的半滑舌鰨被隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5尾魚。試驗(yàn)用魚飼養(yǎng)在容積為300 L的圓形玻璃鋼水槽中。每日投喂 2 次（07：30、17：30），微流水養(yǎng)殖且每天換水2次，每日換水量為水體總體積的1/2，投飼率為1%，根據(jù)魚體增重情況進(jìn)行適量調(diào)整。養(yǎng)殖水溫保持（23.7±0.5）℃，pH值7.89±0.12，養(yǎng)殖水體氨氮含量維持在（0.05±0.03）mg/L，亞硝酸鹽含量維持在（0.02±0.02）mg/L，溶氧含量為（6.23±0.48）mg/L，鹽度16.26±1.88，24 h連續(xù)充氣，以此方法養(yǎng)殖約3個(gè)月，養(yǎng)殖的前7天為暫養(yǎng)期，以進(jìn)一步排除病魚及其他異常魚，且讓試驗(yàn)魚適應(yīng)養(yǎng)殖條件和養(yǎng)殖管理策略。隨后各組魚以相應(yīng)飼料飼喂馴化至各組魚攝食達(dá)到體重的1%后開始正式養(yǎng)殖試驗(yàn)。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為60天。

1.2 飼料配制及成分測(cè)定

四組飼料中基本成分完全一致（配方詳見表1），僅肉桂醛和益生菌含量有差別，如表2所示，空白對(duì)照組-P1組投喂不含肉桂醛（含空白包埋物）的顆粒料，P2、P3和P4組為試驗(yàn)組，P2組飼料在制備過(guò)程中添加了1 000 mg/kg環(huán)糊精-肉桂醛包合物。P3組投喂不含肉桂醛（含空白包埋物）的顆粒料，在投喂飼料前以生理鹽水溶解菌粉，拌于飼料中，使得益生菌的濃度約為 1×107CFU/g。P4 組飼喂添加 1 000 mg/kg環(huán)糊精-肉桂醛包合物的飼料，并在飼喂前噴灑益生菌。

表1 飼料配方組成

表2 試驗(yàn)飼料四種處理

飼料營(yíng)養(yǎng)成分：粗蛋白51.67%、粗脂肪14.30%、粗灰分9.36%、水分7.90%、鈣2.69%、磷0.28%。

飼料中粗蛋白含量采用杜馬斯灼燒法（GB/T 24318-2009）；粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T 50096-2010）；粗灰分含量采用550 ℃高溫灼燒法（GB/T 50094-2010）；水分含量測(cè)定采用 105 ℃常壓恒溫烘干法（GB/T 50093-2010）；鈣含量采用高錳酸鉀法（GB/T 6436-2002）；磷含量采用分光光度法（GB/T 64375-2010）。

1.3 樣本采集

各組半滑舌鰨飼喂不同飼料60天后，取樣前禁食24 h，從每組的隨機(jī)撈取9尾（每缸3尾）半滑舌鰨，以間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（商品名為MS-222）以及低溫冰水麻醉試驗(yàn)魚。在冰浴條件下解剖取半滑舌鰨腸道，在1%甲醛溶液中固定待用。

1.4 腸道切片的制備與觀察

制作前腸組織石蠟切片，以HE染色，以麥克奧迪MoticBA600Mot全自動(dòng)顯微鏡掃描，觀察腸道絨毛高度、絨毛厚度、絨毛分支、絨毛末端膨大情況，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以及固有層炎癥浸潤(rùn)情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

切片采用麥克奧迪數(shù)字切片助理1.0軟件采集量化數(shù)據(jù)并生成圖片，數(shù)據(jù)采用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)處理后，使用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用多重比較法進(jìn)行組間差異顯著性分析，顯著水平為0.05。本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)數(shù)據(jù)包含50根絨毛的信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌和肉桂醛改善前腸絨毛結(jié)構(gòu)

飼喂普通飼料的對(duì)照組半滑舌鰨前腸橫切片清晰地展示了前腸的漿膜（Se）、肌層（MC）、黏膜下層（Su）（見圖1-A）。對(duì)照組小腸絨毛的小腸絨毛高度較高、密度大，少數(shù)絨毛末端膨大。另外有少數(shù)絨毛很短。絨毛表層有排列整齊的柱狀上皮細(xì)胞，外部紋狀緣染成紅色，其核位于細(xì)胞基部，接近固有膜（圖1-A）。與對(duì)照組相比，飼料中含肉桂醛的P2組小腸絨毛末端膨大比例更高（圖1-D），分布于上皮細(xì)胞中間的杯狀細(xì)胞在部分絨毛中密度增加（圖1-F），但整體平均密度并無(wú)統(tǒng)計(jì)差異（P＞0.05）（表1）。有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的肉桂醛能顯著提高肉雞十二指腸、空腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度，優(yōu)化腸道結(jié)構(gòu)，促進(jìn)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育[12]。本研究中雖未發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨前腸絨毛高度的改變，卻檢測(cè)到絨毛末端的結(jié)構(gòu)變化。這種結(jié)構(gòu)變化可能有利于提高前腸對(duì)飼料中成分的消化吸收能力。飼喂芽孢桿菌的P3組，前腸絨毛出現(xiàn)末端分支（圖1-G），局部增厚（圖1-H），且絨毛中央乳糜管寬度增加（圖1-I）。同時(shí)飼喂肉桂醛和芽孢桿菌的P4組，小腸絨毛密度顯著增加。腸絨毛高度以及寬度的增加有利于提高魚體消化吸收能力。許多研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以改善虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）腸道結(jié)構(gòu)[13]。飼喂芽孢桿菌可以改善中國(guó)白對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）中腸的結(jié)構(gòu)[14]。飼喂凝結(jié)芽孢桿菌可以增加太平洋白蝦（Litopenaeus vannamei）腸道的絨毛高度、寬度和腸道肌層厚度[15]。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）也可以增加太平洋白蝦的腸道上皮高度[16]，腸道絨毛的數(shù)量和高度[17]。除了益生菌外，一些益生元（可促進(jìn)某些益生菌生長(zhǎng)）也能改善魚類腸道結(jié)構(gòu)。如甘露寡糖可以改善金頭鯛（Sparus aurata）的腸道結(jié)構(gòu)[18]。各類低聚糖可以改善紅鼓（Sciaenops ocellatus）的腸道結(jié)構(gòu)，增加了腸道褶皺高度[19]。除了增進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，腸道結(jié)構(gòu)的改善還有利于增強(qiáng)魚體對(duì)病原細(xì)菌的抵御能力[20]。關(guān)于脊椎動(dòng)物的研究表明，腸道固有層的增厚和腸道免疫水平的提高以及腸道結(jié)構(gòu)的成熟密切相關(guān)[21]，這種結(jié)構(gòu)改變更有利于抵抗微生物的入侵[22]。

圖1 各處理組半滑舌鰨前腸切片圖（放大倍數(shù)400）

2.2 芽孢桿菌和肉桂醛刺激腸道免疫

飼喂芽孢桿菌的半滑舌鰨前腸淋巴細(xì)胞分布不像對(duì)照組一樣全部沿基層分布，而有少數(shù)聚集在黏膜下層呈輕微炎性浸潤(rùn)（圖1-K），或者遷移到上皮細(xì)胞之間（圖1-L）。Fronte等發(fā)現(xiàn)飼料中蛋白源改變所引起的金頭鯛（Sparus aurata）腸道絨毛的增厚和分支與輕微的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以及固有層中的炎性浸潤(rùn)共同出現(xiàn)[23]。因此少量淋巴細(xì)胞分布于上皮細(xì)胞間或者黏膜下層，可能有利于提高免疫水平，而不是炎癥的表現(xiàn)。

2.3 芽孢桿菌和肉桂醛影響杯狀細(xì)胞密度

從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知（表3），無(wú)論肉桂醛、芽孢桿菌還是其復(fù)合使用，均顯著降低了前腸肌層厚度。雖然各處理組對(duì)絨毛形態(tài)有一定影響，但各組的絨毛高度和寬度平均值并無(wú)顯著差異。肉桂醛和芽孢桿菌單獨(dú)處理并沒有影響絨毛表層杯狀細(xì)胞的密度，但是二者聯(lián)用顯著降低了杯狀細(xì)胞的密度（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道，魚類腸道杯狀細(xì)胞的功能與研究較為透徹哺乳動(dòng)物并不相同。南方鯰腸道杯狀細(xì)胞的主要分泌物為酸性黏多糖[24]，保護(hù)上皮細(xì)胞免受消化酶的破壞，還可對(duì)堅(jiān)硬食物起到潤(rùn)滑作用。肉桂醛與芽孢桿菌共同使用時(shí)降低了前腸絨毛杯狀細(xì)胞的密度，可能會(huì)影響前腸黏液的分泌。杯狀細(xì)胞分泌的黏液對(duì)于腸道微生物而言是一道重要的抵御屏障，肉桂醛處理后造成的杯狀細(xì)胞密度降低，很有可能增強(qiáng)腸道對(duì)微生物的通透性。不過(guò)肉桂醛本身較強(qiáng)抑菌作用可以在一定程度上降低魚類通過(guò)腸道感染病原微生物的風(fēng)險(xiǎn)。另外，肉桂醛處理后絨毛寬度的增加也能增強(qiáng)對(duì)病原微生物的抵御力。

3 結(jié)論

肉桂醛與芽孢桿菌單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用均能顯著改善半滑舌鰨的前腸結(jié)構(gòu)。增加腸絨毛分支以及寬度，擴(kuò)大乳糜管空間，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及對(duì)病原微生物的抵抗。促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移至上皮細(xì)胞間，或者在黏膜下層，提高魚體的免疫水平。二者聯(lián)用效果更為明顯，不過(guò)芽孢桿菌和肉桂醛聯(lián)用降低了前腸杯狀細(xì)胞密度，可能在一定程度上影響腸道黏液分泌和自身對(duì)外界病原微生物的抵抗作用。

表3 肉桂醛和芽孢桿菌對(duì)半滑舌鰨前腸的影響