結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和Xpert MTB/RIF檢測(cè)在糖尿病并發(fā)菌陰性肺結(jié)核患者診斷中的價(jià)值*

周 祎,張 寧,劉曉榮,劉 莉

陜西省結(jié)核病防治院內(nèi)五科(西安 710100)

結(jié)核病仍是威脅人類(lèi)健康的主要公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題[1]。糖尿病患者是目前臨床常見(jiàn)病及多發(fā)病，也是結(jié)核病的危險(xiǎn)因素之一[2]。另外糖尿病病理過(guò)程也會(huì)影響抗結(jié)核藥物的治療效果及結(jié)核病的預(yù)后[3-4]。因此早診斷、早治療對(duì)結(jié)核病并發(fā)糖尿病的預(yù)后尤為重要。目前肺結(jié)核的診斷主要依賴(lài)于臨床癥狀、胸部X線特征和痰細(xì)菌學(xué)檢查等，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)為結(jié)核診斷提供了確切依據(jù)，但痰菌檢測(cè)易受多種因素影響，據(jù)報(bào)道約60%的肺結(jié)核患者痰涂片表現(xiàn)為抗酸桿菌陰性，從而對(duì)部分患者造成漏診或誤診[5]。結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(T-SPOT.TB)是一種新型的免疫酶技術(shù)，能夠在細(xì)胞水平進(jìn)行結(jié)核桿菌的檢測(cè)。Gen-XpertMTB/RIF試驗(yàn)是WHO推薦用于檢測(cè)結(jié)核病的分子診斷平臺(tái)，是以半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，可在2.5 h內(nèi)檢出TB和利福平的耐藥性，且該方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求不高，明顯縮短了所有可疑結(jié)核患者檢測(cè)時(shí)間。但是目前T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF檢測(cè)對(duì)糖尿病并發(fā)菌陰性肺結(jié)核患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值尚不明確。本研究通過(guò)對(duì)糖尿病并發(fā)菌陽(yáng)性和菌陰性肺結(jié)核患者血液和痰液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核抗體(TB-AB)，T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF檢測(cè)，比較和評(píng)價(jià)T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF檢測(cè)對(duì)糖尿病并發(fā)菌陰性肺結(jié)核患者的診斷價(jià)值。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年7月至2017年8月陜西省結(jié)核病防治院收治的糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者共285例，其中菌陽(yáng)肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者111(42.20%)例，均通過(guò)細(xì)菌學(xué)和臨床診斷確診；菌陰性肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者152 (57.80%)例，均通過(guò)臨床和輔助診斷確診。排除病例22例，其中肺炎12例，非結(jié)核分枝桿菌肺病4例，肺部腫瘤6例。263例患者同時(shí)行結(jié)核抗體、T-SPOT檢測(cè)和Gen-XpertMTB/RIF 檢測(cè),其中男217例，女46例；年齡15～83歲，平均年齡(53.60±13.44)歲。根據(jù)診斷結(jié)果：①菌陽(yáng)組肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者 111例，男91例，女20例 ；年齡16～80歲，平均年齡(53.58±13.22)歲；②菌陰組肺結(jié)核并發(fā)糖尿病152 例，男126例，女26例；年齡15～83歲，平均年齡(53.62±13.65)歲。肺結(jié)核診斷符合國(guó)家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布的《新版肺結(jié)核的分類(lèi)及診斷標(biāo)準(zhǔn)(2018年版)》[6]。糖尿病診斷符合2012年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)糖尿病診療指南中的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

2 檢測(cè)方法

2.1 血清結(jié)核抗體(TB-AB)檢測(cè)：采集住院患者的晨起靜脈血4 ml于帶凝膠的紅帽血清管中，標(biāo)本按常規(guī)法分離、儲(chǔ)存。嚴(yán)格按照MTB IgG和IgM抗體檢測(cè)試劑盒(蛋白抗體)使用說(shuō)明書(shū)(南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司)進(jìn)行操作，采用蛋白芯片法分別檢測(cè)菌陽(yáng)組和菌陰組肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者血清16kD和38kD及LAM蛋白抗體；采用膠體金法檢測(cè)血清MTB-IgG和MTB-IgM抗體。結(jié)果按說(shuō)明書(shū)判斷：上述5種任一抗體結(jié)果陽(yáng)性即判為檢測(cè)陽(yáng)性，血清5種抗體全部陰性判為檢測(cè)陰性。蛋白芯片法和膠體金法檢測(cè)肺結(jié)核患者血清抗結(jié)核抗體操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器，耗時(shí)少，前者約10～30 min，后者約10 min內(nèi)完成。

2.2 T-SPOT.TB檢測(cè)：用肝素抗凝管抽取靜脈血4～6 ml，無(wú)需空腹，輕柔顛倒混勻5-10次，避免溶血及凝結(jié)；做好患者標(biāo)識(shí)，直立放置于室溫(15～25℃)，不得冷凍和冷藏。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照T-SPOT.TB試劑盒(美國(guó)Oxford immuno-tec公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離制備，其次對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行洗滌和計(jì)數(shù)，然后制備工作濃度細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液和抗原加入微孔培養(yǎng)板，置于37℃，于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，洗滌微孔板并加入酶標(biāo)抗體，再洗滌微孔板，加入底物反應(yīng)液，最后進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。根據(jù)抗原A和(或)抗原B孔的反應(yīng)判斷結(jié)果：陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0-5，陽(yáng)性樣本應(yīng)為：抗原A或抗原B斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；當(dāng)對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，陽(yáng)性樣本應(yīng)為：抗原A或抗原B斑點(diǎn)數(shù)≥2×陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。

2.3 Gen-XpertMTB/RIF檢測(cè):收集肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者的即時(shí)痰液標(biāo)本于痰瓶中，擰緊瓶蓋，痰樣本保存于2～8℃，及時(shí)送檢。Gen-XpertMTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)及試劑盒由美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)。按照儀器、試劑操作要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理后，取2 ml加入反應(yīng)盒，將反應(yīng)盒放入檢測(cè)模塊儀器進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下直接觀察測(cè)試結(jié)果，系統(tǒng)報(bào)告為錯(cuò)誤、無(wú)效的結(jié)果不納入結(jié)果統(tǒng)計(jì)中。

3 觀察指標(biāo) ①以肺結(jié)核臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，比較TB-AB、T-SPOT.TB檢測(cè)和Gen-Xpert MTB/RIF檢測(cè)3種方法檢測(cè)糖尿病并發(fā)肺結(jié)核的陽(yáng)性率之間的差異；②比較TB-AB、T-SPOT.TB檢測(cè)和Gen-Xpert MTB/RIF檢測(cè)3種方法在菌陽(yáng)組、菌陰組之間的差異；③比較菌陰組不同性別和年齡段患者三種方法檢出陽(yáng)性率的差異；④檢測(cè)各種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用診斷陽(yáng)性率的變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，TB-AB、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率之間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三種檢測(cè)方法在肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者中陽(yáng)性率的比較 263例臨床診斷為糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者中TB-AB檢出陽(yáng)性163例，陽(yáng)性率為61.98%；T-SPOT.TB檢出陽(yáng)性222例，陽(yáng)性率為84.41%；Gen-XpertMTB/RIF檢出陽(yáng)性188例，陽(yáng)性率為71.48%。三種檢測(cè)方法之間的陽(yáng)性率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.544，P=0.000)。T-SPOT.TB陽(yáng)性率與TB-AB陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.730，P=0.000)；Gen-XpertMTB/RIF檢出陽(yáng)性率與TB-AB檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.325，P=0.021)；T-SPOT.TB陽(yáng)性率與Gen-XpertMTB/RIF陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.785，P=0.000)

2 三種檢測(cè)方法在糖尿病并發(fā)肺結(jié)核菌陽(yáng)組、菌陰組患者陽(yáng)性率的比較 111例糖尿病并發(fā)菌陽(yáng)肺結(jié)核患者中，TB-AB陽(yáng)性率為64.86%(72/11)；T-SPOT.TB檢出陽(yáng)性率為89.19%(99/111)；Gen-XpertMTB/RIF陽(yáng)性率為77.47%(86/111)。152例糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核患者中，TB-AB陽(yáng)性率為59.87%(72/152)，T- SPOT.TB陽(yáng)性率為80.92%(123/152)，Gen-XpertMTB/RIF陽(yáng)性率為67.11%(102/152)。卡方檢驗(yàn)顯示：菌陽(yáng)組和菌陰組之間三種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.068，P=0.410和P=0.066)。

3 不同年齡和性別糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核患者中三種檢測(cè)方法陽(yáng)性率的差異 我們比較了三種結(jié)核檢測(cè)方法對(duì)不同年齡和性別糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核患者中陽(yáng)性率的差異，結(jié)果如表1所示：三種方法在男性患者和女性患者中的檢出陽(yáng)性率相當(dāng)，比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，根據(jù)年齡分層后，在不同年齡患者三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在相同年齡段的患者中，T-SPOT.TB陽(yáng)性率較高，Gen-XpertMTB/RIF次之，結(jié)核抗體陽(yáng)性率較低。

表1不同年齡和性別糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核患者中三種檢測(cè)陽(yáng)性率的比較[例(%)]

4 結(jié)核抗體、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF聯(lián)合應(yīng)用檢出陽(yáng)性率比較 我們進(jìn)一步分析了三種方法聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)核檢出陽(yáng)性率的影響，結(jié)果如表2所示：2種方法或3種方法聯(lián)合使用，檢出率均有所提高。T-SPOT.TB與結(jié)核抗體或Gen-XpertMTB/RIF聯(lián)用，菌陰組TB陽(yáng)性率均達(dá)到90%以上，而三種聯(lián)用時(shí)菌陰組檢測(cè)陽(yáng)性率則達(dá)到94.73%。三種方法單獨(dú)使用或聯(lián)合應(yīng)用，其陽(yáng)性率在菌陰組和菌陽(yáng)組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2TB-AB、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF聯(lián)合診斷陽(yáng)性率比較[例(%)]

討 論

2017年WHO全球結(jié)核病報(bào)告指出，2016年全球新發(fā)結(jié)核病1040萬(wàn)例，中國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者89.5萬(wàn)例，因此，結(jié)核病仍是威脅人類(lèi)健康的主要公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題[1]。2015年全球糖尿病患病率達(dá)到8.8%，即估計(jì)全球共有4.15億糖尿病患者，其中75%來(lái)自低收入國(guó)家.中國(guó)是世界上糖尿病患者最多的國(guó)家，糖尿病患者是結(jié)核病的高危人群。據(jù)報(bào)道，我國(guó)肺結(jié)核患者中有超過(guò)10%患有糖尿病，糖尿病人新發(fā)肺結(jié)核是正常人的3倍[8]。糖尿病患者血糖持續(xù)高水平可引起機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致免疫力低下，且高血糖為結(jié)核菌繁殖提供良好培養(yǎng)基，從而增加易感性；血糖過(guò)高可造成機(jī)體內(nèi)環(huán)境呈酸性，有利于結(jié)核菌的生長(zhǎng)及繁殖；另外糖尿病可累及肺部，導(dǎo)致微血管病變和氣道黏膜受損，有利于結(jié)核菌的繁殖。另外，與單純TB患者相比，合并糖尿病患者表現(xiàn)出更高的分枝桿菌載量、肺部空洞比例、更高的耐藥性以及更高的復(fù)發(fā)率和病死率。因此，糖尿病患者的不斷增加對(duì)全球結(jié)核病的控制造成威脅。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者，對(duì)控制兩病共流行的疫情意義重大。但目前結(jié)核病病原學(xué)診斷率低，2017年全球結(jié)核病報(bào)告指出，我國(guó)登記的肺結(jié)核患者中，細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性率僅為31%[9]，難以滿足臨床診斷的需求，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)雖是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其生長(zhǎng)緩慢耗時(shí)，不適合結(jié)核病的早期診斷[10]。結(jié)核病血清免疫診斷的臨床應(yīng)用研究逐漸成為全球結(jié)核領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在臨床廣泛應(yīng)用，但存在假陽(yáng)性及假陰性的問(wèn)題，從而影響著臨床診斷[10]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼一些結(jié)核分枝桿菌特異性復(fù)合抗原，如ESAT-6和CFP-10，它們是重要的T淋巴細(xì)胞抗原，可以被結(jié)核桿菌感染的免疫活性T淋巴細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生高水平的IFN-γ[11]。T-SPOT.TB是由酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)發(fā)展而來(lái)，通過(guò)以ESAT-6和CFP-10刺激外周血單核細(xì)胞中的結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌IFN-γ與否來(lái)判定是否感染結(jié)核，其敏感性和特異性可達(dá)到83%～97%[12-13]。但它不能鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏感染而不推薦用于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷[14-15]。楊宜英等[16]報(bào)道，T-SPOT.TB在菌陽(yáng)和菌陰結(jié)核中的陽(yáng)性率分別為95.5%和85.9%。劉佳慶等[17]的研究中，T-SPOT.TB在菌陰結(jié)核中的陽(yáng)性率為83.7%。本研究中糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核患者中T-SPOT.TB陽(yáng)性率為80.92%，與前述研究結(jié)果接近，表明T-SPOT.TB在糖尿病患者中也具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

Gen-XpertMTB/RIF試驗(yàn)是WHO推薦用于檢測(cè)結(jié)核病的分子診斷平臺(tái)，是以半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)的81bp核心區(qū)為靶序列，可在2.5 h內(nèi)檢出MTB和利福平的耐藥性，且該方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求不高，明顯縮短了可疑結(jié)核患者檢測(cè)所需時(shí)間[18-20]。部分研究表明，隨著分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)入結(jié)核病領(lǐng)域，先進(jìn)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)可以明顯提高病原學(xué)陽(yáng)性率。但其成本高，不適合在基層單位廣泛開(kāi)展。Gen-XpertMTB/RIF近年發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法比較，敏感度和特異度均明顯升高[21-22]。目前，關(guān)于Gene-Xpert MTB/RIF在菌陰性肺結(jié)核中的檢測(cè)陽(yáng)性率的報(bào)道也存在較大差異。陳子芳等[23]作者的研究顯示：126例菌陰性結(jié)核患者中 Gene-Xpert MTB/RIF痰檢陽(yáng)性患者49例，陽(yáng)性率僅為38.89%，而支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)陽(yáng)性率為53.17%。蔡向敬等[24]最近的報(bào)道中，317例菌陰性結(jié)核患者Gene-Xpert MTB/RIF法的檢出率為61.40%。本文中Gene-Xpert MTB/RIF的檢出率為67.11%，與后者較接近。我們也發(fā)現(xiàn)在菌陰組Gene-Xpert MTB/RIF的檢出率顯著低于T-SPOT.TB，這可能是由于菌陰組患者痰液樣本中的菌含量較低，甚至可能低于Gene-Xpert MTB/RIF的檢出限，使其陽(yáng)性率低于T-SPOT.TB對(duì)血液樣本中的檢出率。此外，Gene-Xpert MTB/RIF與T-SPOT.TB聯(lián)用后，菌陰性結(jié)核的陽(yáng)性率達(dá)到92%，檢出率較大幅度升高，更有助于快速診斷。

綜上，在糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核患者中，T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF方法診斷效率高于傳統(tǒng)的結(jié)核抗體檢測(cè)，從而有助于糖尿病并發(fā)菌陰肺結(jié)核的快速診斷，但是其診斷效能仍需更多的臨床樣本予以證實(shí)。