藏紅花素對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

?；ɡ伲?娟，楊新光，于敬妮

西安市第四醫(yī)院(西安710004)

視網(wǎng)膜具有神經(jīng)纖維層、光感受器和Müller細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，對缺血、缺氧損傷及其敏感，當(dāng)視網(wǎng)膜發(fā)生缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury，RIRI)時(shí)，可造成不同程度的視網(wǎng)膜損傷，在血液再通后，視功能反而下降，視網(wǎng)膜損傷加重。RIRI是一個(gè)多因素綜合作用的結(jié)果。以往的研究發(fā)現(xiàn)RIRI的機(jī)制與炎癥反應(yīng)學(xué)說、氧自由基、鈣超載、凋亡因素[1]、興奮性谷氨酸及能量代謝障礙等密切相關(guān)。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜在發(fā)育過程中自身產(chǎn)生，除具有支持和營養(yǎng)視網(wǎng)膜的功能外[2]，還對視網(wǎng)膜上許多大分子和離子起控制和調(diào)節(jié)作用。在Müller細(xì)胞上存在的一些特定部位能夠通過迅速清除細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元胞體和突觸周圍的微環(huán)境，發(fā)揮視網(wǎng)膜上信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)功能。膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)是Müller細(xì)胞內(nèi)重要的中間絲蛋白，在生理狀態(tài)下，其表達(dá)為陰性。當(dāng)Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜病變或者脫離時(shí)，可出現(xiàn)GFAP表達(dá)量增加，這說明Müller細(xì)胞活化參與視網(wǎng)膜的各種病理性改變[3]。鳶尾科植物藏紅花，由多種揮發(fā)性化合物和數(shù)種非揮發(fā)性化合物構(gòu)成，其中具有藥理學(xué)活性的代謝物可分為三大類：藏紅花素、藏紅花苦素、藏紅花醛。其中藏紅花素是藏紅花的有色成分，且是主要成分[4]。我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素可通過PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抗缺血再灌注視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[5]。本研究以藏紅花素為切入點(diǎn)，通過前房灌注復(fù)制大鼠急性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，通過觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)、測定GFAP來評估藏紅花素對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)對象：健康SD大鼠(由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)40只，體重200～250 g，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均排除眼部及全身疾病。主要試劑：兔抗鼠GFAP多克隆抗體購于武漢博士德試劑公司；SP試劑盒、DAB顯色劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司；藏紅花素凍干粉購于美國Sigma公司，藏紅花素化學(xué)式C44H64O24。

2 實(shí)驗(yàn)方法 采用生理鹽水將藏紅花素凍干粉稀釋成濃度為0.5%的藏紅花素溶液。利用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、缺血再灌注模型組、藏紅花素給藥高、低劑量組(各10只)。正常組不予任何處理，缺血再灌注組造模前3 d每天給予腹腔注射生理鹽水10 ml。高、低劑量組在造模前3 d同一時(shí)間點(diǎn)分別給予腹腔注射藏紅花素50、5 mg/(kg·d)[5]。模型組、藏紅花素低劑量組和藏紅花素高劑量組采用前房灌注生理鹽水升高眼內(nèi)壓法建立RIRI模型。SD大鼠腹腔注射20%水合氯醛/生理鹽水溶液(400 mg/kg)，眼表滴用2%丁卡因麻醉，待麻醉滿意后將連接生理鹽水瓶輸液管的4.5號(hào)頭皮針沿顳側(cè)角膜緣刺入眼前房，5 min內(nèi)緩慢升高輸液瓶至與動(dòng)物垂直距離為150 cm處，形成110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的眼壓[6]，可見球結(jié)膜蒼白，瞳孔對光反射消失，以眼底由紅變白作為眼底血管斷流視網(wǎng)膜缺血的標(biāo)志，維持60 min后，降低輸液瓶高度至與動(dòng)物右眼水平，拔除針頭，輕壓角膜緣，以球結(jié)膜恢復(fù)血供，瞳孔出現(xiàn)紅光反射，視網(wǎng)膜恢復(fù)供血作為進(jìn)入再灌注期的標(biāo)志，RIRI模型建立成功。造模成功的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組，造模時(shí)角膜穿通傷或造模完畢后形成外傷性白內(nèi)障的大鼠被淘汰。再灌注24 h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速摘取眼球后在冰環(huán)境中環(huán)角鞏膜緣切開，棄去前節(jié)和晶狀體，保留眼杯。

3 觀察指標(biāo)及測定方法 ①視網(wǎng)膜透射電鏡標(biāo)本制備。將眼杯在顯微鏡下剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，置于2.5%的戊二醛固定液中4℃固定2 h以上；0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗30 min；1%四氧化鋨固定液4℃后固定2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗10 min；乙醇梯度脫水：30%乙醇10 min、50%乙醇10 min、70%乙醇10 min；70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染2 h或過夜；90%乙醇10 min×2；100%乙醇10 min×3；還氧丙烷置換10 min；環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2 μm，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位，瑞典LKB-Ⅴ型超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片50～70 nm；醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，日本日立H-600透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。②視網(wǎng)膜GFAP免疫組織化學(xué)染色SP法。烤片：石蠟切片入電熱恒溫培養(yǎng)箱60℃，過夜；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水：二甲苯I 20 min，二甲苯II 20 min，100%乙醇I 10 min，100%乙醇II 10 min，95%乙醇 5 min乙醇80% 5 min，70% 乙醇5 min；抗原修復(fù)：置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中用煮沸(95℃，15～20 min)，自然冷卻20 min 以上，間隔10 min，反復(fù)1～2次，0.01 mol/L PBS沖洗3×5 min；滅活內(nèi)源性過氧化物酶：新鮮配置的3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3×5 min；正常羊血清工作液封閉，室溫孵育10 min，傾去不洗；滴加一抗4℃冰箱孵育過夜；PBS沖洗3×5 min；滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗3×5 min;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育30 min；PBS沖洗3×5 min;DAB/ H2O2反應(yīng)染色；自來水充分沖洗；干燥，封片。③染色結(jié)果分析。染色結(jié)果采用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克奧迪有限責(zé)任公司)，每張切片隨即選取5個(gè)高倍視野(×400)，測定積分光密度值。

結(jié) 果

1 再灌注24 h大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層超微結(jié)構(gòu) A示正常組，Müller細(xì)胞較周圍細(xì)胞電子密度高，細(xì)胞核呈V字形，或多角形，核染色質(zhì)較均一，核周細(xì)胞質(zhì)較少，胞體的細(xì)長突起深入周圍的細(xì)胞間(圖1A)。B示缺血再灌注組，Müller細(xì)胞電子密度較周圍細(xì)胞高，細(xì)胞排列緊密數(shù)目較前組增多，部分細(xì)胞體積顯著增大，胞體變圓，細(xì)胞大小不一，胞體突起豐富(圖1B)。C示藏紅花素高劑量組大鼠視網(wǎng)膜，Müller細(xì)胞與正常組類似，細(xì)胞核呈梭形(圖1C)。說明給予高劑量的藏紅花素腹腔注射可以減少視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。D示藏紅花素給藥低劑量組大鼠視網(wǎng)膜電鏡結(jié)果，Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)與缺血再灌注組類似，細(xì)胞電子密度較高，數(shù)量較多，Müller細(xì)胞的細(xì)長突起位于周圍的細(xì)胞間(圖1D)。說明給予低劑量藏紅花素不足以影響視網(wǎng)膜上Müller的細(xì)胞數(shù)量。

A示正常組：Müller細(xì)胞核呈V字形(×3000)；B示缺血再灌注組：大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞數(shù)目較前組增多，體積增大(×3000)；C示藏紅花素給藥高劑量組：大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞與正常組類似，細(xì)胞數(shù)目較缺血再灌注組少；D示藏紅花素給藥低劑量組：大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)與模型組類似，Müller細(xì)胞的細(xì)長突起包饒旁邊的細(xì)胞(×3000)；↑示Müller細(xì)胞胞體

圖1 再灌注24 h大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層超微結(jié)構(gòu)

2 再灌注24 h大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) A為正常組，Müller細(xì)胞內(nèi)核糖體數(shù)量豐富，核染色質(zhì)均一(圖2A)；B為缺血再灌注組，Müller細(xì)胞核增大變圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量游離核糖體，中間絲蛋白成束排列位于細(xì)胞核周圍(圖2B)；說明在急性高眼壓環(huán)境下，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞核較正常情況下增大，胞質(zhì)內(nèi)中間絲蛋白增多。C組為藏紅花素給藥高劑量組，Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)與A組類似，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體，細(xì)胞核較大(圖2C)。這說明給予高劑量藏紅花素后視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞內(nèi)中間絲蛋白較缺血再灌注組減少。D為藏紅花素給藥低劑量組，Müller細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見中間絲蛋白成束排列，大量核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(圖2D)。這提示，予低劑量藏紅花素腹腔注射，對Müller細(xì)胞內(nèi)中間絲蛋白量不產(chǎn)生影響。

3 視網(wǎng)膜石蠟切片GFAP免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果 A示再灌注24 h后大鼠視網(wǎng)膜矢狀位切片GFAP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，GFAP染色陽性為棕黃色團(tuán)塊狀或顆粒狀，位于細(xì)胞漿內(nèi)。正常大鼠視網(wǎng)膜GFAP陽性染色位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，陽性染色顆粒主要位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體(圖3A)。在缺血再灌注損傷作用下，神經(jīng)纖維層GFAP陽性染色加重，且于內(nèi)核層出現(xiàn)陽性染色(圖3B)。藏紅花素給藥高劑量組GFAP表達(dá)量與正常組類似(圖3C)。藏紅花素給藥低劑量組GFAP表達(dá)量與缺血再灌注組GFAP表達(dá)量類似(圖3D)。

A示正常對照組：Müller細(xì)胞內(nèi)核糖體(↑)(×20000)豐富；B示缺血再灌注組：Müller細(xì)胞核(☆)光密度高，核大，胞質(zhì)可見成束的中間絲(↑)(×25000)；C示藏紅花素給藥高劑量組：Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)與A組類似，可見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體(↑)(×25000)；D示藏紅花素給藥低劑量組：可見Müller細(xì)胞內(nèi)豐富的核糖體(☆)，及成束的中間絲(↑)(×25000)

圖2 再灌注24 h候大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

A示正常組對照組：僅見視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層有微量棕黃色顆粒染色；B示缺血再灌注組：可見節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層大量棕黃色顆粒狀染色；C示藏紅花素給藥低劑量組：GFAP的表達(dá)情況類似正常組，僅見節(jié)細(xì)胞層少量表達(dá)；D示藏紅花素給藥高劑量組：GFAP主要表達(dá)于節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層(ONL 外核層，INL內(nèi)核層，GCL節(jié)細(xì)胞層)。GFAP陽性染色為棕黃色，呈顆粒、團(tuán)塊狀位于胞質(zhì)內(nèi)(↑)

圖3 再灌注24 h大鼠視網(wǎng)膜GFAP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

4 GFAP免疫組化染色積分光密度值比較 見表1。再灌注24 h后，模型組和藏紅花給藥低劑量組視網(wǎng)膜組織中GFAP表達(dá)量較對照組及藏紅花給藥高劑量組增加，單因素方差分析結(jié)果提示各組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；SNK法兩兩比較，對照組和高劑量組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，模型組和低劑量組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，對照組、高劑量組與模型組、低劑量組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1GFAP免疫組化染色積分光密度值比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與RIRI模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05

討 論

Müller細(xì)胞是哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之一，占視網(wǎng)膜細(xì)胞總量的90%左右。在胚胎發(fā)育過程中與視網(wǎng)膜神經(jīng)元有著共同的干細(xì)胞來源，故其與視網(wǎng)膜的關(guān)系密切[7]。在光鏡下觀察視網(wǎng)膜HE染色切片，區(qū)分Müller細(xì)胞與其它視網(wǎng)膜細(xì)胞很困難。在透射電鏡下可清楚地看到Müller細(xì)胞胞體主要位于內(nèi)核層，Müller細(xì)核電子密度比周圍其他細(xì)胞高，呈橢圓形或多角形，染色質(zhì)顆粒均勻分布。相比細(xì)胞核，核周胞質(zhì)較少且電子密度較大，呈薄薄一層圍繞在細(xì)胞核周圍。在胞質(zhì)中可見少量細(xì)絲、散在分布的圓形線粒體以及囊泡狀大小不一的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Müller細(xì)胞胞體向視網(wǎng)膜內(nèi)外側(cè)各分出兩個(gè)方向相反較粗大的突起，穿過神經(jīng)視網(wǎng)膜全層，同時(shí)內(nèi)外側(cè)突起還向水平方向發(fā)出分支突起，同胞體一樣，Müller細(xì)胞突起內(nèi)的胞質(zhì)的電子密度較高。突起所在的胞質(zhì)內(nèi)含有細(xì)絲、高爾基體及糖原顆粒，線粒體多集中于突起頂部。

我們的大鼠網(wǎng)膜切片內(nèi)核層電鏡觀察結(jié)果為：正常組的Müller細(xì)胞較周圍節(jié)細(xì)胞電子密度高，細(xì)胞體有大量的突起，長短不一的突起分支廣泛分布于視網(wǎng)膜各類神經(jīng)元胞體和神經(jīng)纖維之間，或貼附在毛細(xì)血管壁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)絲狀的膠質(zhì)纖維酸性蛋白；與對照組相比，缺血再灌注組的結(jié)果為Müller細(xì)胞數(shù)量較前組增多，細(xì)胞體積顯著增大，分支增多，胞質(zhì)內(nèi)中間絲蛋白增多，呈束狀排列于細(xì)胞核周圍；藏紅花素高劑量組的Müller細(xì)胞及各細(xì)胞器形態(tài)與正常組接近，低劑量組者與模型組接近。對照正常組和缺血再灌注組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)上支持Müller細(xì)胞是維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)的重要骨架的證據(jù)：在內(nèi)核層Müller細(xì)胞的突起發(fā)出分支環(huán)繞周圍的神經(jīng)細(xì)胞胞體，這有利于維持視網(wǎng)膜微環(huán)境的穩(wěn)定。同時(shí)Müller細(xì)胞在維持正常的視網(wǎng)膜谷氨酸代謝、營養(yǎng)支持神經(jīng)元及保持血-視網(wǎng)膜屏障完整性等方面有著較為重要的作用[8]。

將正常組和缺血再灌注組相比，我們觀察到Müller細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變主要為細(xì)胞肥大，有絲分裂增多，細(xì)胞內(nèi)中間絲蛋白更加豐富。對比藏紅花素高劑量(50 mg/kg)和缺血再灌注組可發(fā)現(xiàn)，藏紅花素使用高劑量組，無論是內(nèi)核層Müller細(xì)胞形態(tài)，胞體突起數(shù)量及長度還是Müller細(xì)胞胞質(zhì)中核糖體、中間絲的數(shù)量均少于對照組，而藏紅花素給藥低劑量組內(nèi)核層及Müller細(xì)胞形態(tài)均與缺血再灌注類似，這說明使用藏紅花素高劑量腹腔注射能夠有效抑制Müller細(xì)胞的活化。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是一種相對分子質(zhì)量為(50～52)×103的胞質(zhì)內(nèi)絲狀蛋白，是Ⅲ型中間絲蛋白，是Müller細(xì)胞的主要骨架蛋白。正常情況下，成熟的大鼠Müller細(xì)胞及其終板上均不表達(dá)GFAP蛋白，在糖尿病性視網(wǎng)膜病變、缺血等情況下，Müller細(xì)胞上GFAP表達(dá)量增加，因此GFAP可作為視網(wǎng)膜上Müller細(xì)胞反應(yīng)性活化的重要標(biāo)志[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷組Müller細(xì)胞表達(dá)GFAP量較對照組顯著增加，藏紅花素高劑量組GFAP表達(dá)量較模型組低，接近對照組，低劑量組者GFAP的表達(dá)量接近模型組。對比各個(gè)組GFAP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可推斷，在急性高眼壓引起的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷過程中，Müller細(xì)胞參與其中并發(fā)生活化，表達(dá)GFAP增多，使用藏紅花素50 mg/kg能夠顯著降低視網(wǎng)膜GPAP表達(dá)量，抑制Müller細(xì)胞過度活化。

本實(shí)驗(yàn)中，對比缺血再灌注組和藏紅花素給藥高劑量組，從Müller細(xì)胞形態(tài)、胞體突起數(shù)量及長度、Müller細(xì)胞內(nèi)核糖體及中間絲的數(shù)量及GFAP蛋白在視網(wǎng)膜上的表達(dá)量上，可以看出，使用藏紅花素高劑量腹腔注射能夠有效抑制Müller細(xì)胞活化。Müller細(xì)胞活化是組織對病理損害的防御性反應(yīng)，本意為組織修復(fù)和重塑，促進(jìn)功能恢復(fù)。如果生長因子的分泌足夠多，Müller細(xì)胞其對外界刺激的反應(yīng)程度適中則會(huì)起到保護(hù)作用，若膠質(zhì)細(xì)胞過度活化導(dǎo)致膠質(zhì)增生或膠質(zhì)細(xì)胞活化的持續(xù)時(shí)間過長，會(huì)造成神經(jīng)元損傷[10]。但是在Müller細(xì)胞活化過程中，其對視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用往往小于對視網(wǎng)膜造成的損傷。Müller細(xì)胞活化后細(xì)胞表面的Kir4通道的減少，使其緩沖細(xì)胞外K+的能力下降，發(fā)生去極化，從而影響Müller細(xì)胞對突觸間隙谷氨酸的重?cái)z取能力，使視網(wǎng)膜組織谷氨酸堆積。谷氨酸對光感受器細(xì)胞具有神經(jīng)毒性，谷氨酸大量蓄積能造成視力損害。我們以藏紅花為切入點(diǎn)，復(fù)制大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，觀察發(fā)現(xiàn)藏紅花素通過抑制Müller細(xì)胞過度活化，減輕其對視網(wǎng)膜的損害，從而發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

本研究證實(shí)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后24 h視網(wǎng)膜組織GFAP蛋白表達(dá)顯著增加，說明Müller細(xì)胞活化在視網(wǎng)膜缺血再灌注過程中發(fā)揮作用，藏紅花素50 mg/kg可使GFAP表達(dá)下調(diào)，提示藏紅花素能通過抑制Müller細(xì)胞過度活化而發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。