加巴噴丁對感染后咳嗽大鼠肺組織瞬時受體電位香草酸亞型1、P 物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽的影響研究*

李天浩，王惠琴，高小娟，胡 晨，任加良

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

感染后咳嗽(Post-infectious cough，PIC)是指感冒急性期過后，仍咳嗽不止，多持續(xù)3～8周[1]。目前認(rèn)為，PIC是由于咳嗽敏感性增高所致，而氣道神經(jīng)源性炎癥則是導(dǎo)致咳嗽敏感性增高的重要因素之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)，加巴噴丁能顯著改善慢性咳嗽患者癥狀，咳嗽頻率及咳嗽嚴(yán)重程度均較安慰劑組顯著下降[3-4]，但其治療慢性咳嗽的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過加巴噴丁對PIC大鼠肺泡灌洗液(Bronchoalverlar alveolar lavage fluid，BALF)和肺組織瞬時受體電位香草酸亞型1(Transient receptor potential vanilloid subtype 1，TRPV1)、P 物質(zhì)(P substance ，SP)及降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)的影響，探討加巴噴丁對PIC氣道神經(jīng)源性炎癥的干預(yù)作用機(jī)制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物:清潔級、雄性SD大鼠60只，180～240 g，購于西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(陜)2012-003。實驗大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3～7 d。本研究符合陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會相關(guān)要求并審批通過。

1.2 實驗試劑：加巴噴丁膠囊：國藥準(zhǔn)字號：H20040527，規(guī)格：0.1×48粒。辣椒素購于合肥四峰生物科技有限公司。LPS、SP、CGRP ELISA試劑盒均購于美國Sigma公司。TRPV1試劑盒購于英國Abcam公司。

2 研究方法

2.1 實驗分組及模型建立：將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組，每組20只，參照文獻(xiàn)[5-6]方法建立PIC模型。將實驗大鼠置于1m3的特制的煙室中，每日用鋸末50 g、香煙10支，點燃進(jìn)行煙熏，每日煙熏40 min，1次/d。連續(xù)10 d，大鼠每日自由進(jìn)食、飲水，分別于第13天、16天、19天，用10%水合氯醛經(jīng)腹腔內(nèi)注射將大鼠麻醉，然后經(jīng)鼻腔滴入濃度為0.4 mg/ml的LPS液，分別于第14天、15天和第17天、18天以及第20天，將大鼠置于特制的誘喘容器中，用10-4mol/L的辣椒素溶液霧化吸入，每次霧化吸入3 min，1次/d。

2.2 給藥方法：各組大鼠于試驗第14天起開始灌胃給藥，連續(xù)10 d。正常組、模型組均給藥0.9%氯化鈉注射液10 ml/kg灌胃給藥，1次/d，西藥組給予加巴噴丁(膠囊3粒0.3 g去殼，將藥粉溶于0.9%氯化鈉注射液300 ml，配制成1 mg/ml)，5 ml/kg灌胃給藥，1次/d。

2.3 指標(biāo)檢測:① 結(jié)束給藥后，觀察每組大鼠的咳嗽次數(shù)，觀察3 min并記錄。② 肺泡灌洗液(BALF)中TRPV1、SP、CGRP含量測定: 將大鼠麻醉后迅速開胸，并結(jié)扎右主支氣管，同時經(jīng)左主支氣管向左肺內(nèi)緩慢注入0.9%氯化鈉注射液4 ml，保留10 s，回抽后再次緩慢注入，重復(fù)3次。收集BALF后經(jīng)低溫3000 r/min離心10 min后，取上清液置于-80度冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格按試劑盒說明進(jìn)行ELISA檢測。③ 肺組織病理標(biāo)本制備:在向左主支氣管灌注同時，迅速取下右肺，并用10%多聚甲醛液固定后，取材石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察肺組織病理學(xué)變化。④ 免疫組化法檢測肺組織TRPV1、SP、CGRP蛋白表達(dá) : 肺組織石蠟切片脫蠟、水合，3%過氧化氫室溫孵育10 min，抗原修復(fù)，室溫封閉30 min，一抗 4℃過夜，HRP 標(biāo)記免疫組化二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素、伊紅復(fù)染。免疫組化圖片結(jié)果采用 Leica 顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，比較蛋白表達(dá)強度(灰度)，行半定量分析。

結(jié) 果

1 各組大鼠咳嗽次數(shù)比較 模型組大鼠咳嗽次數(shù)明顯增多，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)西藥干預(yù)后，大鼠咳嗽次數(shù)明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)義(P<0.05)。見表1。

表1大鼠3min咳嗽次數(shù)比較

注：與模型組比較，*P<0.05

2 各組大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP測定比較 正常組大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP均輕度表達(dá)，模型組以上各指標(biāo)均明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 經(jīng)西藥干預(yù)后，西藥組大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP表達(dá)均減低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 光鏡下，正常組(圖1A)支氣管黏膜無水腫，可見少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組(圖1B)支氣管黏膜水腫，上皮脫落，肺泡壁輕度水腫，上皮變性、壞死、脫落，間質(zhì)充血、水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。西藥組(圖1C)病理改變類似模型組，但總體炎性改變較模型組輕。

表2各組大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP含量比較(ng/L)

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.05

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)(HE染色)

4 各組大鼠肺組織TRPV1、SP、CGRP免疫組化檢測結(jié)果 見表3。與正常組比較，模型組、西藥組大鼠肺組織TRPV1、SP、CGRP蛋白均升高(P<0.05)；與模型組比較，西藥組大鼠肺組織TRPV1、SP、CGRP蛋白表達(dá)減低(P<0.05)。

表3各組大鼠肺組織TRPV1、SP、CGRP比較(灰度值)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

討 論

咳嗽是臨床常見病癥，程度有輕有重，嚴(yán)重者影響人們的學(xué)習(xí)、工作和生活。臨床上依據(jù)咳嗽持續(xù)時間，將咳嗽分為3類：急性咳嗽，是指咳嗽持續(xù)時間小于3周，慢性咳嗽，是指咳嗽持續(xù)時間大于8周，介于3～8周者稱之為亞急性咳嗽，PIC即屬于此類咳嗽范疇。

PIC是由于咳嗽敏感性增高所致，但其發(fā)病機(jī)制未完全闡明，目前認(rèn)為與瞬時受體電位(TRP)通路激活、氣道炎癥、氣道神經(jīng)源性炎癥關(guān)系密切[7]。TRPV1位于哺乳動物C類神經(jīng)纖維，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、肺、支氣管、皮膚等組織器官，是機(jī)體一種重要的傷害性感受分子，可對多種有害刺激做出反應(yīng)[8]。TRPV1是首個被證實能夠介導(dǎo)豚鼠咳嗽反射的TRP通道[9]，能上調(diào)咳嗽敏感性，其數(shù)量與咳嗽反應(yīng)強度正相關(guān)[10]。當(dāng)呼吸道感染病毒后，BALF中前列腺素E2(PGE2)的合成明顯增加，并與EP受體結(jié)合，通過與EP受體藕連的G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，經(jīng)過 CAMP/PKA 機(jī)制激活和敏化TRPV1 通道[11]。激活的TRPV1可引起大量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)肽增多，包括SP、CGRP等。SP和其受體廣泛分布于呼吸道，包括氣道上皮、腺體、平滑肌[12]。當(dāng)氣道受到感染、煙霧等刺激后，SP釋放增多，再次刺激C纖維，釋放更多的神經(jīng)肽，刺激氣道咳嗽感受器引起咳嗽[13-14]。CGRP也是主要的神經(jīng)源性介質(zhì)之一，位于氣道上皮C類神經(jīng)纖維，當(dāng)氣道受到理化刺激后，其合成與釋放也增多，引起咳嗽反射[15]。這些炎癥介質(zhì)相互作用，導(dǎo)致咳嗽敏感性增加。因此，PIC的主要特征是咳嗽敏感性增高并伴有SP、CGRP 增高為特點的氣道神經(jīng)源性炎癥。這些氣道神經(jīng)源性炎癥主要是通過肺內(nèi)一種稱之為中性內(nèi)切酶(Neutral endopeptidase,NEP)來降解，從而使這些介質(zhì)的產(chǎn)生與釋放處于動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)咳嗽敏感性。

多目前為止，PIC尚缺乏有效的治療藥物。加巴噴丁是神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)受體激動劑，常用于帶狀皰疹后疼痛、糖尿病外周神經(jīng)痛及復(fù)雜局部疼痛綜合征的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，加巴噴丁用于慢性咳嗽治療，也取得了良好的療效，且患者對其副作用也可較好的耐受，但對其作用機(jī)制尚不明確。

本研究表明，與模型組相比，加巴噴丁能有效減少大鼠咳嗽次數(shù)，降低大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP含量，減輕大鼠肺組織炎癥反應(yīng)。因此，我們推測，加巴噴丁可能是通過干預(yù)TRPV1、SP、CGRP來降低PIC氣道神經(jīng)源性炎癥，從而達(dá)到治療PIC。