CRISPR/Cas9介導(dǎo)煙草多基因編輯體系的應(yīng)用

謝小東，高軍平，李澤鋒，張劍鋒，魏攀，羅朝鵬，王晨，武明珠，翟妞，楊軍

1 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，國家煙草基因研究中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001；

2 湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，長沙市勞動中路386號 410008

基因編輯技術(shù)可以精準(zhǔn)地對基因組中的靶位點(diǎn)進(jìn)行缺失、敲入以及核苷酸修正等操作。CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）基因組編輯技術(shù)問世以來，彌補(bǔ)了第一代的鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）和第二代的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）基因編輯技術(shù)的諸多不足。因CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯基因的高效性、特異性和設(shè)計的便捷性，已成為當(dāng)前最主流、最熱門的基因組編輯技術(shù)，在大量物種中得到了廣泛應(yīng)用。

CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可抵抗病毒或外源性DNA的侵染。CRISPR/Cas9編輯技術(shù)是利用導(dǎo)向RNA識別靶位點(diǎn)，并引導(dǎo)Cas9蛋白切割靶序列[1-2]。CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種類型（Type Ⅰ、Type Ⅱ和Type Ⅲ）?，F(xiàn)在廣泛用于基因編輯技術(shù)的CRISPR/Cas系統(tǒng)是根據(jù)Type II型系統(tǒng)改造而來的。Type Ⅱ型系統(tǒng)由Cas9核酸酶、pre-crRNA和反式激活crRNA組成。在前導(dǎo)序列的調(diào)控下，CRISPR的間隔序列被轉(zhuǎn)錄成為pre-crRNA。借助tracrRNA，RNase III再將pre-crRNA加工為成熟的crRNA，并形成具有切割活性的tracrRNA-crRNA-Cas9復(fù)合體。隨著對CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷優(yōu)化，crRNA和tracrRNA被融合成為一條單鏈引導(dǎo)RNA（singleguide RNA，sgRNA）。sgRNA的表達(dá)通常用III型RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄，PAM（protospacer adjacent motif）序列決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割的位點(diǎn)[3]。隨著基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，科學(xué)家開發(fā)了不同CRISPR/Cas9系統(tǒng)，不斷在提升CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用價值。

2013年，科學(xué)家首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對擬南芥[4]、水稻和小麥基因組的定點(diǎn)編輯[5]，證明了該技術(shù)在植物生物學(xué)研究領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價值。隨后CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于高粱[6]、玉米[7]、甜橙[8]、番茄[9,10]、大豆[11]、大麥[12]、甘藍(lán)[12]、棉花[13]、甘蔗[14]等作物中，在性狀改良、基因調(diào)控、抗性育種以及高通量突變體文庫創(chuàng)制等方面得到了廣泛應(yīng)用[15]。高軍平等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別對煙草NtPDS和NtPDR6基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變[16]，首次在普通煙草中建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系。本課題組利用CRISPR/Cas9技術(shù)在煙草中鑒定了一個腋芽生長相關(guān)基因NtPIN4，將基因突變后煙草腋芽數(shù)目比野生型明顯增多，且突變類型和表型均能夠穩(wěn)定遺傳至下一代[17]。潘洪杏等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對煙草馬鈴薯Y病毒（Potato Y virus,PVY）基因eIF4E進(jìn)行了定向編輯[18]。姚恒等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對煙草茉莉酸信號關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因NtabMYC2進(jìn)行了編輯，獲得了不同敲除類型的突變體[19]。

隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，在許多物種中同時編輯多個基因的技術(shù)逐步成熟。在楊樹毛白楊中，通過構(gòu)建多靶點(diǎn)編輯載體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了同時敲除楊樹基因組上兩個同源的PDS編碼基因（PtPDS1和PtPDS2）[20]。在水稻和擬南芥中，構(gòu)建的多基因敲除體系能夠成功突變擬南芥和水稻基因家族的多個基因、以及單個基因的多個靶點(diǎn)，在轉(zhuǎn)化體第一代就獲得有表型的突變體[21]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻育種中間材料中同時編輯TMS5、Pi21和Xa13基因，成功將具有優(yōu)良性狀的育種中間材料快速開發(fā)成優(yōu)質(zhì)多抗的兩系不育系[22]。通過構(gòu)建多基因敲除體系，同時對編碼擬南芥核糖體大亞基AtRPL10亞家族的三個同源基因AtRPL10A，AtRPL10B及AtRPL10C進(jìn)行了編輯，轉(zhuǎn)基因植株的三個同源基因均存在基因突變[23]。

煙草是異源四倍體農(nóng)作物，多基因編輯體系的建立與應(yīng)用，對加快煙草基因功能的研究和遺傳改良的有著重要的意義。在煙草中，針對多個基因、尤其是不同性狀相關(guān)基因的同時編輯的研究尚未有報道。為此，基于煙草中已有的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，本文選取以下5個靶基因開展CRISPR/Cas9介導(dǎo)多基因編輯研究。eIF4E是轉(zhuǎn)錄起始因子（eukaryotic translation initiation factors 4E），PVY病毒通過自身的基因組連接蛋白（viral genome-linked protein,VPg）與植物的特定eIF4E基因家族成員相互作用，從而啟動病毒在植物體內(nèi)的翻譯與增殖。eIF4E基因突變會導(dǎo)致其表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)改變或缺失，使病毒無法利用eIF4E蛋白侵入植株[24]。本生煙、辣椒以及普通煙草中突變或者下調(diào)eIF4E基因，均能使植株對PVY產(chǎn)生一定的抗性[25,26]。TOM1和TOM3是煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的抗性相關(guān)基因，研究發(fā)現(xiàn)TOM3蛋白與TMV病毒特異的結(jié)合，進(jìn)而將病毒復(fù)制復(fù)合體整合到質(zhì)膜之上，保證病毒的復(fù)制[27]。Sunil Kumar等通過構(gòu)建TOM1和TOM3的干擾載體，進(jìn)而下調(diào)煙草中的這兩個基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對TMV的抗性明顯增強(qiáng)[28]。在本氏煙中克隆了擬南芥同源基因NbTOM1，分析證明病毒誘導(dǎo)NbTOM1沉默后，幾乎完全遏制了本氏煙中TMV的復(fù)制，同時干擾沙姆遜煙草的TOM1和TOM3基因后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草能夠有效地抑制TMV的生長和擴(kuò)散[29]。課題組前期克隆了煙草植物螯合肽基因NtPCS1，利用RNAi技術(shù)降低NtPCS1基因的表達(dá)量之后，煙草葉片中的鎘含量顯著降低。利用TILLING技術(shù)將鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA2的突變后，在鎘脅迫下，與對照相比突變體煙葉中的鎘含量降低36.84%[30]。本文通過對上述5個煙草不同性狀的基因開展CRISPR/Cas9多基因編輯的探索研究，旨在為煙草多個（性狀）基因的功能研究和遺傳改良提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法：

1.1 材料

普通栽培煙草K326無菌苗培養(yǎng)于國家煙草基因研究中心的人工氣候室：將K326種子放入1.5 mL離心管中，加入1 mL 15% 次氯酸鈉溶液消毒15 min，無菌水清洗5～6次，用牙簽播種于MS固體培養(yǎng)基中。MS固體培養(yǎng)基成分為：4.4 g/L MS（Murashinge ＆ Skoog Basal Mediun） 培養(yǎng)基、30 g/L蔗糖、2.5 g/L植物凝膠。培養(yǎng)條件為相對濕度60%，光照16 h/28 ℃，黑暗8 h/25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計及載體構(gòu)建

利用煙草基因組序列信息，通過在線工具CRISPR MultiTargeter（http：//www.multicrispr.net/index.html），設(shè)計了如下的編輯位點(diǎn)（表1）。將各靶位點(diǎn)序列分別接上U26啟動子和終止后依次串聯(lián)，并在串聯(lián)的5'端和3'引入酶切Bsa I位點(diǎn)后合成序列，然后利用BsaI酶切，并與預(yù)先用BsaI酶切過的CRISPR/Cas9載體連接。連接體系：酶切載體 3 μL，退火產(chǎn)物 2 μL，Solution I 5 μL。16 ℃連接30 min，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h。用 U26-JC F：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'和各靶序列下游引物對菌斑進(jìn)行陽性克隆的PCR擴(kuò)增、克隆和測序篩選。

1.2.2 煙草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因敲除靶位點(diǎn)的cDNA克隆

以中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因的cDNA序列，設(shè)計可擴(kuò)增PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2sgRNA序列的cDNA片段引物。PCS1-cl F：5'-GAAGACTCCAAGACTACCGGG-3'，PCS1-cl R：5'-GCCAATTCGCAACTAACTTCA-3'，eIF4E-cl F：5'-GTAGTCGACGATGGACCTGAA-3'，eIF4E-cl R：5'-CATGAAATATGAAGCCAATCG-3'，TOM3-cl F：5'-GGATGGGCTTAGACCTAGTTT-3'，TOM3-cl R：5'-TTAGCGAATAGGGTGGTACTG-3'，TOM1-cl F：5'-TGTTGTAAATGGAGTTCGTGC-3'，TOM1-cl R：5'-CTCTTTTTGGAGGCAATTTTC-3'，HAM-cl F：5'-GCATTAGCAACAGCTGACATT-3'，HAM-cl R：GCGATGAGAATGAAAACCAC-3'，以 K326品種的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：基因上、下游引物（10 μM）各1 μL、DNA樣品（100 ng/μL）1 μL、Taq酶12.5 μL，加 ddH2O補(bǔ)足至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。待PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化PCR產(chǎn)物。用TOPO-TA PCR克隆試劑盒進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，菌落PCR陽性單克隆送測序。

1.2.3 敲除載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及煙草遺傳轉(zhuǎn)化

將測序成功的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)法將重組編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。具體的遺傳轉(zhuǎn)化方法見王姍姍 等[33]。

1.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化株的獲得及突變位點(diǎn)檢測

待再生植株的根系生長良好后，移出組培瓶于基質(zhì)中，置于培養(yǎng)條件為相對濕度60%，光照16 h/28 ℃、黑暗8 h/25 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采集適量煙株葉片，提取基因組DNA。具體步驟參照GeneAnswer GenePure新型植物基因組DNA快速提取試劑盒說明書。設(shè)計Cas9蛋白基因檢測引物，Cas9-JC F：5'-CTCAACACAACATATACAAAACAAA-3'，Cas9-JC R 5'-CTTTGGCCATCTCGTTTGA-3'，以各植株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確認(rèn)外源DNA片段是否已經(jīng)插入到植物基因組中。PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.2。

將滾子從動件的滾子中心視為尖底從動件的尖底，則滾子從動件的凸輪機(jī)構(gòu)即成為尖底從動件的凸輪機(jī)構(gòu)，因此文中僅研究后者。

設(shè)計擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)的150bp-180bp DNA片段的引物，以檢測目的基因是否成功被編輯。PCS1-JC F：5'-ATTGCCAGCAGTAACTTTGATGTT-3',PCS1-JC R：5'-GCCTAGTCCTAATTTTTTACTTGCC-3',eIF4EJC F：5'-ATTGGACAATGAGCTTTAGTAAGGG-3',eIF4E-JC R：5'-TTCATTTGCAGCATTCTTGGTC-3',TOM3-JC F：5'-ATGAAAGGTGGAGTAAT ACTTGTCT-3',TOM3-JC R：5'-TCAATCAT ATCCAGGTAAGAAAAGT-3',TOM1-JC F：5'-CTGTTCATTGGGAATTCGTAT TOM1-JC R：5'-GGGAGGAGAATGTAGTGAGGAA,HMA2-JC F：5'-AGCAGGTTATCCATTGGTTTG-3',HMA2-JC R：5'-TGACATCTTGGAACACACACC-3'。分別在以上各正向引物的5'端前加ggagtgagtacggtgtgc，反向引物5'前加gagttggatgctggatgg。以Cas9陽性煙株DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.2。待PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，備用進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。第二輪PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 9.0 μl、Hi-TOM Mix 10 μl、第一輪 PCR 產(chǎn)物1.0 μl。94℃，預(yù)變性 2 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 1 kb/min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 結(jié)束后取3-5 μL 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴(kuò)增完畢的第二輪PCR 產(chǎn)物混合，取混合后的PCR 產(chǎn)物200 μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化。送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.2.5 脫靶分析

以各基因靶位點(diǎn)序列為種子序列，分別在煙草基因組中數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，在全基因范圍內(nèi)尋找可能存在的脫靶位點(diǎn)。在候選脫靶位點(diǎn)序列位點(diǎn)上、下游設(shè)計引物擴(kuò)增，通過測序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多基因敲除靶位點(diǎn)的sgRNA設(shè)計

利用中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因的cDNA序列，通過CRISPR MultiTargeter在線軟件對PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2設(shè)計了 CRISPR/Cas9敲除的sgRNA寡聚核苷酸序列，再將設(shè)計的各sgRNA序列與基因組DNA進(jìn)行了聯(lián)配分析，篩選出高特異性sgRNA，并排除sgRNA序列夸兩個外顯子的可能性，獲得如表1所示的候選的sgRNA。

表1 多基因敲除的sgRNA寡聚核苷酸序列Tab.1 The sgRNA oligonucleotide sequences of multiple genes

2.2 煙草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因的sgRNA區(qū)域驗(yàn)證

為了排除基因組測序過程中造成的堿基誤差，確保敲除靶位點(diǎn)序列的特異性和準(zhǔn)確性，進(jìn)一步對含有靶位點(diǎn)sgRNA序列的cDNA片段進(jìn)行了測序驗(yàn)證。通過設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，以K326品種的cDNA為模板，分別擴(kuò)增了PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2含有靶位點(diǎn)序列的cDNA片段，如圖1所示，從K326中均擴(kuò)增到預(yù)期大小的cDNA片段，并進(jìn)行了純化與克隆。測序分析顯示，PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2cDNA片段中的sgRNA序列和PAM區(qū)與表1中所設(shè)計的sgRNA序列及PAM區(qū)完全一致，可以作為Cas9對相應(yīng)基因敲除的sgRNA。

圖1 煙草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2 cDNA片段電泳檢測與測序Fig.1 Electrophoresis detection and sequencing of partial cDNA sequence of tobacco PCS1,eIF4E,TOM3,TOM1 and HMA2

2.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)多基因敲除的sgRNA設(shè)計與構(gòu)建

在每個sgRNA上下游分別引入擬南芥U-26啟動子和終止序列，用于獨(dú)立啟動和終止sgRNA表達(dá)，再將各獨(dú)立的sgRNA表達(dá)元件依次串聯(lián)后，在5'端和3'引入酶切BsaI位點(diǎn)，獲得如圖2A所示的串聯(lián)sgRNA片段。利用BsaI酶切的方法將該串聯(lián)片段連接至pORE-Cas9植物表達(dá)載體上。分別以U26-JC F和PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2sgRNA的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過凝膠電泳檢測顯示，5個sgRNA以及載體片段均被擴(kuò)增到，并呈現(xiàn)出按序排列清晰條帶（圖2B），符合預(yù)期目標(biāo)。這表明已經(jīng)成功構(gòu)建了針對PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因敲除的CRISPR/Cas9表達(dá)載體。

圖2 多基因敲除的Crispr/Cas9載體構(gòu)建Fig.2 Construction of Crispr/Cas9 vector for multi-gene knockout

提取重組CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒，采用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，對經(jīng)過卡那霉素和利福平篩選的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，所用引物為U26-JC F和PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2sgRNA的反向序列。如圖2C所示，得到預(yù)期300 bp左右大小的目的條帶，表明重組CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株內(nèi)。

2.4 T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株的檢測

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將重組CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草K326，經(jīng)過卡那霉素篩選，獲得了17株T0代遺傳轉(zhuǎn)化陽性苗。待幼苗長至4～6片葉時，提取葉片基因組DNA，以檢測編碼Cas9蛋白基因的Cas9-JC F和Cas9-JC R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，從13株煙草中擴(kuò)增出預(yù)期500 bp左右的Cas9基因片段（圖3），表明構(gòu)建的重組CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入K326植株中。

2.5 煙草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2突變靶位點(diǎn)的擴(kuò)增與突變分析

設(shè)計特異性引物，以各陽性植株DNA為模板，擴(kuò)增包含突變靶位點(diǎn)在內(nèi)的150 bp-180 pb的PCR產(chǎn)物。第二輪PCR擴(kuò)增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用Hi-Tom試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增與加測序接頭的PCR反應(yīng)，其產(chǎn)物比第一輪長100 bp左右。第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小如圖4所示，純化回收后進(jìn)行建庫測序。

測序結(jié)果分析顯示，PCS1基因在靶位點(diǎn)處發(fā)生了多種形式的突變，包括在不同位點(diǎn)處的1個、2個、4個、5個和10個堿基的刪除和1個堿基的插入（圖5A），大多數(shù)突變發(fā)生在PAM區(qū)域附近。Cas9對TOM3基因同樣進(jìn)行了成功編輯，分析顯示在TOM3-sgRNA序列處主要發(fā)生了1個堿基和2個堿基的刪除（圖5 B）。另外，在TOM3-sgRNA位點(diǎn)處分別發(fā)現(xiàn)了1個堿基的替換和1個堿基的插入突變。在TOM1-sgRNA序列處有4個不同位點(diǎn)1個堿基的刪除、一個位點(diǎn)2個堿基的刪除以及2個不同位點(diǎn)T→C的堿基替換（圖5C）。在eIF4E-sgRNA位點(diǎn)主要以堿基刪除為主，包括4個不同位點(diǎn)1個堿基的刪除、1個位點(diǎn)4個堿基和1個位點(diǎn)2個堿基的刪除（圖5D），這三種形式的刪除突變均可導(dǎo)致eIF4E基因在煙草中的功能喪失。對HMA2基因的測序結(jié)果分析顯示，HMA2-sgRNA位點(diǎn)處不僅有1個堿基的刪除，還存在3個、6個和8個堿基的刪除（圖5E）。根據(jù)靶位點(diǎn)中堿基突變的reads與總測序reads的比值，評估了Cas9對靶位點(diǎn)處編輯效率。Cas9對PCS1、TOM3、TOM1、eIF4E、HMA2靶位點(diǎn)處的編輯效率分別約為13.1%、15.1%、6.1%、19.8%和16.8%。

上述分析結(jié)果表明，Cas9對以上5個基因均實(shí)現(xiàn)了成功編輯，獲得了不同突變類型的T0代植株，堿基突變類型主要以1個堿基的刪除為主，約占總突變類型的50%以上，其次是2個堿基的刪除以及多個堿基的刪除，1個堿基的插入也是導(dǎo)致基因突變的重要因素。在各植株中仍然存在野生型基因序列，因此，T0代突變株為嵌合體。

圖3 T0代植株中Cas9基因片段PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoretogram of the sequence fragments of the Cas9 gene，DL 2000 Marker K326； Wild -type plant of K326；1～13,Transgenic plants

圖4 靶位點(diǎn)序列的PCR電泳圖Fig.4 PCR electrophoretogram of target sequence

對PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因在13棵T0代植株中的突變分布做了維恩分析，如圖6所示，PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA25個基因同時在7棵T0代植株中得到成功突變，這7棵T0代植株分別為 T0-4，T0-5，T0-6，T0-8，T0-9，T0-10和T0-11。5個基因在同一株煙草同時突變的檢出率為53.8%。其余植株中均有不同基因突變的組合，且突變基因數(shù)目均在3個或3個以上，而單個基因突變的檢出率在76.9%與92.3%之間，表明多基因敲除系統(tǒng)具有較高的編輯效率。

圖5 Cas9介導(dǎo)煙草PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因突變注：紅色為sgRNA序列，括號中分別標(biāo)注了突變的堿基與對應(yīng)的植株編號； WT：野生型Fig.5 Cas9-mediated targeted mutations of PCS1,eIF4E,TOM3,TOM1 and HMA2 in tobacco.Note：sgRNA sequence is marked in red,and the mutated bases and the corresponding plant number are marked in parentheses.WT：Wild Type

圖6 PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因在T0代植株中的突變分布Fig.6 Mutation distribution of PCS1,eIF4E,TOM3,TOM1 and HMA2 in T0 Generation plants

2.6 脫靶位點(diǎn)預(yù)測與檢測分析

由于與靶序列的相似，Cas9可能出現(xiàn)非特異性切割而發(fā)生脫靶現(xiàn)象。為了分析本文所構(gòu)建的CRISPR/Cas9多基因編輯系統(tǒng)是否存在脫靶現(xiàn)象，我們將PCS1、eIF4E、TOM3、TOM1和HMA2基因的靶位點(diǎn)序列與煙草基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了對比分析，根據(jù)（(N)12NGG）的原則和PAM區(qū)上游序列（12 bp）決定靶位點(diǎn)特異性的原則[31,32]，分別在煙草全基因組范圍內(nèi)各篩選了一個最有可能脫靶的候選位點(diǎn)，如表2所示，各基因靶位點(diǎn)從第8-10位點(diǎn)開始到PAM序列，完全與脫靶候選位點(diǎn)序列匹配。通過設(shè)計特異性引物，在5個基因都有突變的7株陽性植株中擴(kuò)增候選脫靶位點(diǎn)的DNA片段，測序結(jié)果表明并未發(fā)現(xiàn)突變序列，這表明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有較高的特異性。

表2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶位點(diǎn)分析與檢測Table 2 Analysis and examination of mutations in the putative off-target sites of CRISPR/Cas9 system.

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)自出現(xiàn)以來，已在各植物中得到非常廣泛應(yīng)用。煙草是最早建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作物之一，Gao等人最早在煙草中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功突變NtPDS和NtPDR6基因。隨后，該系統(tǒng)在煙草腋芽、次生代謝、抗逆性等生物學(xué)性狀的單基因功能研究方面發(fā)揮了重要作用[16-17,33-34]。本文基于煙草中已有CRISPR/Cas9基礎(chǔ)表達(dá)系統(tǒng)，首次在煙草中針對不同生物學(xué)性狀的多個基因開展了編輯研究。

構(gòu)建了鎘積累相關(guān)基因PCS1和HMA2、PVY抗性相關(guān)基因eIF4E、TMV抗性相關(guān)基因TOM3和TOM15個靶基因同時敲除的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)化至煙草中。通過對陽性植株靶位點(diǎn)的基因序列分析表明，5個靶基因在煙草中均得到了成功編輯，5個基因同時突變的檢出率為53.8%，該比例與水稻中對四個靶位點(diǎn)同時敲除的比例相當(dāng)（44%和67%）[35]，而單基因突變的檢出率在76.9%與92.3%之間，這與煙草單基因突變的陽性植株檢測率相當(dāng)[16,17]。這表明本文構(gòu)建的多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠針對不同性狀的不同基因進(jìn)行編輯，為煙草不同優(yōu)良性狀的種質(zhì)改良提供重要的技術(shù)依據(jù)。另外，由于普通煙草是由二倍體的絨毛狀煙草和林煙草雜合而來的異源四倍體，在其基因組中有兩套不同二倍體野生煙草基因組類型，因而存在同源基因數(shù)量多、基因功能冗余的現(xiàn)象。本文中構(gòu)建的多靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可有效應(yīng)用于多個煙草基因的突變，提高煙草功能基因研究效率。

測序結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在煙草中引起的突變，主要是1至10個堿基的刪除，其中1個堿基刪除的突變類型最多，這與前期在煙草和其他植物中所得出的結(jié)果一致，這種突變形式很大程度上與植物內(nèi)在的修復(fù)機(jī)制相關(guān)。另外，由于普通煙草是由二倍體的絨毛狀煙草和林煙草雜合而來的異源四倍體，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜且較大，在T0獲得純合突變的概率不高，多個基因的純合突變篩選需更多的種植代數(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)引導(dǎo)核酸酶定向剪切活性存在一定程度的容錯概率，會在目標(biāo)位點(diǎn)序列相似的基因組區(qū)域存在非特異剪切活性（脫靶效應(yīng)）?；蚓庉嫲形稽c(diǎn)預(yù)測方法較多，全基因組測序是目前被認(rèn)為最有效的方法。對擬南芥、水稻、棉花中Cas9或Cpf1的脫靶效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，造成脫靶效應(yīng)的最主要因素是gRNA特異性，sgRNA嚴(yán)謹(jǐn)性設(shè)計將有效消除脫靶效應(yīng)的潛在影響[36-38]。本研究在5個基因同時發(fā)生突變的植株中，根據(jù)sgRNA特異性識別靶點(diǎn)原則預(yù)測和分析了可能的脫靶點(diǎn)，結(jié)果表明未發(fā)生脫靶現(xiàn)象，與前期在煙草中對CRISPR/Cas9脫靶檢測結(jié)果一致[16]。這可能與目標(biāo)基因的sgRNA均采用嚴(yán)謹(jǐn)標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，所設(shè)計靶序列均是全基因范圍錯誤匹配最低以及GC含量合理的sgRNA。更全面的脫靶評估有待于后續(xù)進(jìn)一步對純合體突變體的全基因組測序分析研究。

4 結(jié)論

本研究針對煙草不同性狀的基因構(gòu)建了多靶點(diǎn)敲除的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，獲得了鎘積累相關(guān)基因NtPCS1、HMA2、PVY抗性相關(guān)基因eIF4E以及TMV抗性相關(guān)基因TOM3、TOM1同時突變煙草遺傳材料，5個基因同時突變的檢出率為53.8%。脫靶效應(yīng)評估分析顯示，在所預(yù)測脫靶的候選位點(diǎn)上均未發(fā)生脫靶現(xiàn)象。本文構(gòu)建的多基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可將煙草多個基因進(jìn)行有效突變，為煙草基因功能的研究和基于CRISPR/Cas9技術(shù)的多性狀改良奠定了基礎(chǔ)。