超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAFV600E檢測(cè)與甲狀腺乳頭狀癌侵襲性病理特征的相關(guān)性

張 穎，羅渝昆，張 艷，張明博，廣 旸，謝 芳，姜 波，唐 杰

1南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 3000712中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心超聲科，北京 100853

近年來，由于精準(zhǔn)診斷技術(shù)如高頻超聲的不斷發(fā)展以及環(huán)境因素的影響，甲狀腺癌的發(fā)病率與檢出率在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)增長(zhǎng)，目前已成為近年來發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)是甲狀腺癌最常見的病理學(xué)類型，占所有甲狀腺癌的85%～90%[1]。大多數(shù)PTC具有惰性生物學(xué)特征，但仍有部分PTC出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或包膜外侵犯等侵襲性病理特征，進(jìn)而改變臨床分期，影響預(yù)后[1-2]。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(fine-needle aspiration，F(xiàn)NA)被視為超聲發(fā)現(xiàn)的甲狀腺可疑結(jié)節(jié)最準(zhǔn)確的診斷方法，具有風(fēng)險(xiǎn)小、準(zhǔn)確性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，在指南中推薦，并在臨床中廣泛應(yīng)用[2]。甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)(Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology，BSRTC)是FNA結(jié)果的規(guī)范解讀，89%～95%的FNA可以得到滿意的解讀，并指導(dǎo)臨床治療[3]。但仍有近40%的FNA結(jié)果是不確定的，使得臨床難以決定手術(shù)治療方案，可能導(dǎo)致不必要的外科干預(yù)，增加醫(yī)療成本及風(fēng)險(xiǎn)[3]。BRAFV600E突變是PTC中最重要的基因突變，其突變率可高達(dá)28%～90%，特異性幾乎達(dá)100%，但BRAFV600E基因突變頻率在不同文獻(xiàn)報(bào)道中差別較大，關(guān)于其突變能否提示PTC侵襲性的說法不一[4-7]。因此，本研究旨在探討超聲引導(dǎo)下FNA、BRAFV600E基因突變檢測(cè)及兩者聯(lián)合與PTC臨床病理特征的相關(guān)性，以期在FNA結(jié)果不確定時(shí)，指導(dǎo)臨床治療方案。

對(duì)象和方法

對(duì)象 選取2016年4月至2017年7月超聲提示甲狀腺可疑惡性結(jié)節(jié)，行超聲引導(dǎo)下FNA及BRAFV600E基因突變檢測(cè)，最終經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為PTC的患者。其中在術(shù)前超聲檢查及術(shù)中探查均未發(fā)現(xiàn)異常淋巴結(jié)者，依據(jù)癌灶位置行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃或不清掃；在術(shù)前超聲發(fā)現(xiàn)異常淋巴結(jié)或在術(shù)中觸及腫大淋巴結(jié)者，依據(jù)異常淋巴結(jié)位置行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃及選擇性或預(yù)防性頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)行甲狀腺切除術(shù)并經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為PTC；(2)術(shù)前均經(jīng)過超聲、FNA檢查及BRAFV600E基因突變檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)拒絕手術(shù)或未于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院行甲狀腺切除術(shù)的患者；(2)手術(shù)病理不明確或?yàn)榱夹圆∽?、除PTC之外的其他惡性病變；(3)甲狀腺腫瘤復(fù)發(fā)或2次手術(shù)的患者。最終263例患者共263個(gè)結(jié)節(jié)(多發(fā)癌灶選擇較大者)納入本研究。檢查前均獲得患者本人知情同意并簽署知情同意書。

超聲引導(dǎo)下FNA 采用百勝M(fèi)yLabTM Twice超聲診斷儀，L 5-12 MHz高頻探頭?；颊呷⊙雠P位，頸部墊枕，頭向后仰充分暴露頸前區(qū)，彩色多普勒超聲選定擬穿刺結(jié)節(jié)，常規(guī)消毒后，以23G或25G針在彩超引導(dǎo)下，針尖進(jìn)至可疑結(jié)節(jié)中心，在無負(fù)壓情況下針尖在結(jié)節(jié)內(nèi)不同部位來回提插10～15次，將穿刺所得樣本立即涂片并置于95%酒精中固定，同時(shí)將穿刺針置于盛有180 μl細(xì)胞裂解液的1.5 ml EP 管中沖洗，以備BRAFV600E檢測(cè)。

FNA病理判讀 由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師依照BSRTC結(jié)果分為Ⅰ～Ⅵ類，Ⅰ類：標(biāo)本不能診斷或不滿意；Ⅱ類：良性病變；Ⅲ類：意義不明確的細(xì)胞非典型病變或?yàn)V泡性病變；Ⅳ類：濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類：可疑惡性腫瘤；Ⅵ類：惡性腫瘤[3]。

BRAFV600E基因檢測(cè) 應(yīng)用廈門艾德公司生產(chǎn)的人類BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒，完全按照其說明書進(jìn)行檢測(cè)。將每例患者穿刺針的沖洗液使用DNA提取試劑盒法提取，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增。BRAFV600E突變檢測(cè)結(jié)果判斷：待測(cè)樣品的內(nèi)控HEX(或VIC)信號(hào)應(yīng)升起；如待測(cè)樣本外控FAM信號(hào)的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)≥28，則樣本為陰性(野生型)，如樣本的FAM信號(hào)Ct值<28，則樣本為陽性(突變型)。

患者病變分期 采用美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)TNM分期方案中的各項(xiàng)描述進(jìn)行[8]。

結(jié) 果

BRAFV600E基因突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系 共納入263例患者，其中男性55例、女性208例，平均年齡(43.4±10.7)歲，45歲以下患者130例、45歲及以上患者133例。263例PTC中，最大徑≤1 cm者[甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)]168例，最大徑>1 cm者(非PTMC)95例。

263例PTC中，F(xiàn)NA診斷敏感度為86.3%(227/263)；BRAFV600E基因突變率為85.9%(226/263)，其中PTMC突變率為91.1%(153/168)，非PTMC突變率為76.8%(73/95)。共225例患者進(jìn)行淋巴結(jié)清掃，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為35.6%(80/225)，其中PTMC轉(zhuǎn)移率為23.8%(34/143)，非PTMC轉(zhuǎn)移率為56.1%(46/82)；包膜外侵犯的患者占9.9%(26/263)。

依照TNM分期，T1 222例(84.4%)、T2 11例(4.2%)、T3 30例(11.4%)。NX(未行淋巴結(jié)清掃，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不明)38例(14.4%)、N0 145例(55.1%)、N1a 46例(17.5%)、N1b 34例(12.9%)。所有患者癌灶未侵及皮下軟組織、喉、氣管、食管或喉返神經(jīng)，均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Ⅰ期225例(85.6%)、Ⅱ期1例(0.4%)、Ⅲ期26例(9.9%)、ⅣA期11例(4.2%)。

每項(xiàng)臨床特征分為兩組進(jìn)行BRAFV600E突變率的比較，其中FNA病理結(jié)果分為標(biāo)本不能診斷或不滿意、良性病變、意義不明確的細(xì)胞非典型病變或?yàn)V泡性病變(不明確診斷)與可疑惡性腫瘤、惡性腫瘤(明確診斷)兩組；腫瘤大小分為最大徑≤1 cm(微小癌)與最大徑>1 cm(非微小癌)兩組；包膜侵犯情況分為無甲狀腺外侵犯與甲狀腺外侵犯兩組；原發(fā)腫瘤T分期分為TI與T2～T3兩組；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為無轉(zhuǎn)移(N0)與有轉(zhuǎn)移(N1a/N1b)兩組；臨床分期分為Ⅰ期與Ⅱ～ⅣA期兩組。BRAFV600E基因突變與年齡(<45 歲/≥45 歲，81.5% 比 90.2%，χ2=4.104，P=0.043)、FNA病理結(jié)果(無法診斷、良性、病理不明確/可疑惡性、惡性，72.2% 比88.1%，χ2=6.484，P=0.011)、是否為微小癌(≤1 cm/>1 cm，91.1% 比76.8%，χ2=10.164，P=0.001)、原發(fā)腫瘤T分期(T1/T2～T3，87.8% 比75.6%，χ2=4.281，P=0.039)有關(guān)，其中年齡≥45 歲、FNA診斷為惡性或可疑惡性、腫瘤最大徑≤1 cm(微小癌)、原發(fā)腫瘤分期為T1者BRAFV600E突變率更高。而BRAFV600E突變與性別(男/女，85.5% 比 86.1%，χ2=0.013，P=0.909)、甲狀腺包膜外侵犯(無甲狀腺外侵犯/甲狀腺外侵犯，86.1% 比 84.6%，χ2=0.000，P=1.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，86.9% 比 78.8%，χ2=2.546，P=0.111)、腫瘤臨床分期(Ⅰ期/Ⅱ期～Ⅳa期，86.7% 比81.6%，χ2=0.696，P=0.404)無關(guān)。

FNA病理結(jié)果與PTC臨床病理特征的關(guān)系 單因素分析顯示FNA診斷敏感度在不同年齡、性別、腫瘤大小、是否有甲狀腺包膜外侵犯、原發(fā)腫瘤T分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。以FNA病理結(jié)果(不明確診斷/明確診斷)為因變量，年齡是否>45歲、性別、腫瘤最大徑是否≥1 cm、是否有甲狀腺包膜外侵犯、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為自變量，進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表1 FNA病理結(jié)果與PTC臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between FNA pathological findings and PTC clinicopathological characteristics

FNA：細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查；PTC：甲狀腺乳頭狀癌；ND/UNS：標(biāo)本無法診斷或不滿意；AUS/FLUS：意義不明的細(xì)胞非典型性病變或?yàn)V泡性病變；SM：可疑惡性腫瘤；淋巴結(jié)未清掃的病例不參與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移中診斷率的比較；a：采用連續(xù)校正χ2值

FNA：fine-needle aspiration；PTC：papillary thyroid cancer；ND/UNS：nondiagnostic or unsatisfactory；AUS/FLUS：atypical cells of undetermined significance/ follicular lesions of undetermined significance；SM：suspicious for malignancy；patients without lymph node dissection did not participate in the comparison of the diagnostic rates in lymph node metastasis；a：continuous correction ofχ2is used

超聲引導(dǎo)下FNA聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測(cè)與PTC侵襲性的關(guān)系 為明確當(dāng)FNA明確診斷且BRAFV600E基因突變時(shí)，是否應(yīng)當(dāng)采取更積極的治療策略，將患者分為FNA與BRAFV600E雙陽性及非雙陽性患者進(jìn)行比較，即以下兩組：FNA病理結(jié)果為Ⅴ、Ⅵ類且BRAFV600E為突變型的患者，及所有FNA病理結(jié)果為Ⅰ～Ⅲ類或BRAFV600E為野生型的患者。單因素分析顯示，兩組在不同臨床病理特征(腫瘤最大徑是否≥1 cm、是否有甲狀腺包膜外侵犯、原發(fā)腫瘤T分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期)中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。以超聲引導(dǎo)下FNA聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測(cè)結(jié)果為因變量，腫瘤最大徑是否≥1 cm、是否有甲狀腺包膜外侵犯、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為自變量，進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

討 論

相關(guān)研究顯示，甲狀腺癌近年在全球范圍內(nèi)發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，但死亡率沒有明顯上升，且增長(zhǎng)的甲狀腺癌主要是PTMC[1]。伴隨著大樣本長(zhǎng)期隨訪研究的進(jìn)行，目前認(rèn)為大多數(shù)PTC，尤其是PTMC預(yù)后良好，一項(xiàng)包含18 445例PTMC患者的研究顯示，其20年生存率可達(dá)95%，疾病特異性死亡率僅0.5%[9]。然而，仍有20%～30%的甲狀腺癌因甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高侵襲性表現(xiàn)影響預(yù)后[1]。因此，對(duì)甲狀腺癌進(jìn)行危險(xiǎn)分層，明確哪些可以積極隨訪觀察、哪些必須及時(shí)手術(shù)治療，以及進(jìn)行何種術(shù)式治療尤為重要。

表2 FNA病理結(jié)果影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果Table 2 Logistic regression analysis of influencing factors of FNA pathological results

表3 超聲引導(dǎo)下FNA聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測(cè)與PTC臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Ultrasound-guided FNA combined with BRAFV600E gene mutation detection and its relationship with PTC clinicopathological characteristics

淋巴結(jié)未清掃的病例不參與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移中病理結(jié)果的比較

Patients without lymph node dissection did not participate in the comparison of pathological results in lymph node metastasis

表4 超聲引導(dǎo)下FNA聯(lián)合BRAFV600E基因突變檢測(cè)的Logistic回歸分析結(jié)果Table 4 Logistic regression analysis of ultrasound-guided FNA combined with BRAFV600E mutation detection

FNA是目前術(shù)前診斷甲狀腺結(jié)節(jié)最可靠的方法，但仍有近40%的FNA結(jié)果是不確定的，使得臨床難以決定治療方案[3，10]。為了提高FNA的診斷價(jià)值，近年分子基因檢測(cè)已成為研究熱點(diǎn)，其中BRAFV600E突變?cè)赑TC中最為常見，其突變率可高達(dá)28%～90%[7]。有研究認(rèn)為當(dāng)FNA病理結(jié)果更明確時(shí)可提示PTC高侵襲性[4]，而BRAFV600E在判斷PTC侵襲性中的價(jià)值近年一直存在爭(zhēng)議[4-7]。本研究通過結(jié)合FNA結(jié)果及BRAFV600E突變情況，與手術(shù)病理及臨床分期相對(duì)照，探討超聲引導(dǎo)下FNA聯(lián)合BRAFV600E檢測(cè)與PTC侵襲性病理特征的相關(guān)性，為臨床治療提供參考依據(jù)。

本研究共納入263例手術(shù)病理證實(shí)為PTC的患者，仍有36例術(shù)前FNA病理不明確，F(xiàn)NA診斷敏感度為86.3%，與相關(guān)研究結(jié)果[11]相近。對(duì)比分析FNA診斷為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類及Ⅴ、Ⅵ類的PTC，兩組患者在不同年齡分組、性別、腫瘤大小、是否有甲狀腺包膜外侵犯、原發(fā)腫瘤T分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Vanderlaan等[5]認(rèn)為患者的性別、年齡、腫瘤是否多發(fā)與FNA診斷明確與否無關(guān)，但FNA診斷為Ⅵ類的PTC傾向于更高的臨床分期，Ⅲ類時(shí)則多數(shù)最終證實(shí)為濾泡亞型PTC，表現(xiàn)為更低的侵襲性。然而，本研究FNA最初診斷為Ⅲ類的PTC中，有1例為彌漫硬化型PTC，為高侵襲性亞型，術(shù)前已發(fā)生明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)NA診斷不明確的原因可能是穿刺時(shí)無法對(duì)癌灶進(jìn)行準(zhǔn)確定位。此外，36例FNA結(jié)果不明確的PTC中，PTMC占77.8%(28/36)，在剩余的8例非PTMC中，除1例彌漫硬化型PTC外，4例伴橋本氏甲狀腺炎，1例伴周圍腺體腺瘤樣增生，因此，穿刺標(biāo)本不足或受到周圍腺體良性病變的影響可能是導(dǎo)致FNA結(jié)果不明確的原因，并非因侵襲性低所致。

本研究BRAFV600E基因突變與年齡、是否為微小癌、原發(fā)腫瘤T分期有關(guān)，而與性別、甲狀腺包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期無關(guān)。其中年齡≥45 歲、腫瘤最大徑≤1 cm(微小癌)、原發(fā)腫瘤分期為T1者BRAFV600E突變率更高。這一結(jié)果與Trovisco等[6]的研究結(jié)果相似。Trovisco等[6]通過分析來自7所醫(yī)院的多中心數(shù)據(jù)，得出BRAFV600E與PTC大小、血管侵犯、甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高侵襲性特征無關(guān)，而與年齡有關(guān)，年齡大者BRAFV600E突變率更高。在年老的人群中BRAFV600E突變率更高，可能是帶有BRAFV600E突變的PTC更容易出現(xiàn)在年老的人群中，或者是在同等年齡的人群中，帶有BRAFV600E突變的PTC進(jìn)展更慢。而后一種假設(shè)表明BRAFV600E突變并不意味高侵襲性，反而可能相對(duì)于其他類型的基因突變使PTC表現(xiàn)得更為惰性，而這一假設(shè)也可以解釋本研究的結(jié)果。腫瘤最大徑≤1 cm、原發(fā)腫瘤分期為T1均為低侵襲性指標(biāo)，并且本研究2例彌漫硬化型PTC及1例低分化PTC均未見BRAFV600E突變。本研究PTMC占63.9%(168/263)，BRAFV600E在PTMC中的突變率(91.1%)顯著高于非PTMC(76.8%)(P=0.001)，造成整體BRAFV600E突變率升高，研究對(duì)象的不同也可能是導(dǎo)致與一些研究結(jié)論[12]相反的原因。由于PTC相對(duì)良好的臨床預(yù)后與BRAFV600E基因的高突變率，不良事件的發(fā)生與BRAFV600E突變之間缺乏相關(guān)性是合乎邏輯的[13]。此外，在進(jìn)展迅速的兒童PTC、彌漫硬化型PTC等高危亞型中罕有BRAFV600E突變也可說明這一結(jié)論[14]。

有研究指出，明確的FNA結(jié)果與BRAFV600E突變同時(shí)存在可以預(yù)測(cè)PTC更高的侵襲性與臨床分期[4]。為明確當(dāng)FNA明確診斷且BRAFV600E基因突變時(shí)，是否應(yīng)當(dāng)采取更積極的治療策略，本研究進(jìn)一步將FNA與BRAFV600E雙陽性及非雙陽性患者進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)兩組患者在不同臨床及病理特征下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，不論是FNA明確診斷為惡性，還是BRAFV600E存在突變，都不應(yīng)是擴(kuò)大甲狀腺切除范圍或者對(duì)臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者進(jìn)行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃的指征。在今后的研究中，應(yīng)找尋除BRAFV600E外更適于評(píng)價(jià)PTC侵襲性的分子診斷指標(biāo)，建立更加有效的甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)分層體系。

綜上，F(xiàn)NA病理結(jié)果及BRAFV600E基因突變檢測(cè)與PTC的侵襲性病理特征無相關(guān)性，雙陽性的結(jié)果與更高侵襲性病理特征也無相關(guān)性。由于BRAFV600E在低侵襲性PTMC中的高突變率，其在評(píng)估PTC侵襲性中的價(jià)值受限。