哈巴苷對H2O2誘導的大鼠心肌細胞H9c2氧化應激損傷的保護作用

心血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一，也是導致我國病人猝死的主要原因[1]。隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率和致死率也呈逐年上升趨勢[2-3]。心肌缺血、高血壓、高血脂、糖尿病及過度疲勞均是導致心血管疾病的重要因素[4]。近年來大量研究表明，氧化應激誘導的心肌細胞凋亡在心血管疾病發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[2， 5]。心肌細胞是一類高度分化的細胞，心肌細胞的凋亡會導致心臟功能減退，最終導致心臟功能衰竭[6]。因此，尋找新的藥物抑制氧化應激、減少心肌細胞凋亡是目前心血管疾病治療研究的熱點。白毛夏枯草是我國常用中草藥，常用于治療風濕病、關(guān)節(jié)炎、胃腸道功能紊亂等疾病，具有較強的抗炎活性[6]。哈巴苷(harpagide， HG) 是白毛夏枯草的主要活性成分，近年來研究表明哈巴苷也具有抗炎活性[7]，并且還能對抗谷氨酸鹽誘導的氧化應激損傷，從而抑制大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞的凋亡[8]。但其對心肌細胞氧化應激的作用還少見報道。本研究采用H2O2處理心肌細胞H9c2，誘導心肌細胞氧化損傷，以研究哈巴苷對心肌細胞氧化應激的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 哈巴苷 (貨號：6926-080-5) 購自上海一研生物科技有限公司，分子式為C15H24O10，分子量為364.35，純度≥98%。DMEM/F12培養(yǎng)液 (貨號：11330032)、胰酶 (貨號：25200114) 和胎牛血清 (貨號：12483020) 購自美國Invitrogen公司，Hoechst 33256染色液 (貨號：C1027)、RIPA裂解液 (貨號：P0013C) 和BCA試劑盒 (貨號：P0010) 購自上海碧云天生物科技公司。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase， SOD，貨號：A001-3)、丙二醛 (malondiadehyde， MDA，貨號：A003-1)和谷胱甘肽 (glutathione， GSH)試劑盒 (貨號：A006-1) 購自南京建成生物工程研究所。Caspase-3(貨號：ab13847)、Caspase-9(貨號：ab32539)、Bcl-2 (貨號：ab182858) 和Bax (貨號：ab32503) 一抗和山羊抗兔二抗(貨號：ab6721)均購自英國Abcam公司。二氯熒光乙酰乙酸鹽(2’，7’-Dichloroflurescein diacetate， DCF-DA， 貨號：35845) 購自美國Sigma公司。 哈巴苷的化學結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 哈巴苷的化學結(jié)構(gòu)式

1.2 細胞培養(yǎng) 大鼠心肌細胞H9c2購自美國ATCC (貨號：CRL-1466)。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將H9c2細胞培養(yǎng)于37 ℃ 5% 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中，并保持濕度在95%以上，2 d換液1次。細胞融合率達到90%以上時對細胞進行傳代培養(yǎng)，種板密度為1×104個/mL。

1.3 細胞分組及模型復制 將細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，隨機分為H9c2組、哈巴苷組、H2O2組和H2O2+哈巴苷組。將細胞培養(yǎng)24 h后，H2O2組和H2O2+ 哈巴苷組加入終濃度為150 μmoL的 H2O2處理3 h，隨后哈巴苷組和H2O2+ 哈巴苷組更換為含有4 μmoL 哈巴苷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其余兩組更換為正常培養(yǎng)液。24 h后收集上清液，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 CCK8檢測細胞活性 將細胞接種于96孔板中，種板密度為1×105個/mL。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK8試劑，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后檢測細胞活性，計算細胞增殖倍數(shù)，增殖倍數(shù)=細胞吸光度/0 h H9c2組細胞吸光度×100%。

1.5 Hoechst染色檢測細胞凋亡 用H2O2和哈巴苷處理細胞并吸走上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，每孔加入500 μL的Hoechst染色液，重新置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，30 min后用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 檢測SOD、MDA和GSH活性 取出細胞培養(yǎng)上清液置于4 ℃冰箱中待其完全融化后再恢復室溫，用離心機以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速離心4 min后，取上清液根據(jù)試劑盒說明書檢測上清液中SOD、MDA和GSH的濃度。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒對蛋白質(zhì)含量進行定量分析并調(diào)平。用12% SDS-PAGE分離蛋白，采用半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜，并用5%的脫脂牛奶室溫封閉2h。2h后吸去脫脂牛奶，加入Caspase-3(1∶1 000)、Caspase-9 (1∶1 000)一抗、Bcl-2 (1∶1 200)和Bax (1∶1 000)，4 ℃封閉過夜。第2天洗去未結(jié)合一抗，加入二抗 (1∶1 200)，室溫孵育1 h后，洗去未結(jié)合二抗，滴加化學發(fā)光顯色液曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析。

1.8 二氯熒光素 (DCF)法檢測活性氧(ROS)活性 將細胞接種于6孔板中，細胞密度為5×105個/mL。培養(yǎng)24 h后，加入 10 μmoL的DCF-DA，室溫孵育10 min后，加入4%的多聚甲醛室溫固定細胞5 min，用流式細胞儀檢測DCF的熒光強度。

2 結(jié) 果

2.1 哈巴苷對心肌細胞增殖的影響 與H9c2組比較，哈巴苷組細胞增殖倍數(shù)無明顯變化，H2O2組細胞增殖倍數(shù)明顯降低 (P<0.01)；哈巴苷處理細胞4 d后，與H2O2組比較，H2O2+哈巴苷組細胞增殖倍數(shù)明顯升高(P<0.05)，表明哈巴苷能減弱H2O2對心肌細胞增殖的抑制作用。詳見圖2。

與H9c2組比較，*P0.01；與H2O2組比較，#P0.05圖2 哈巴苷對心肌細胞增殖的影響

2.2 哈巴苷對心肌細胞凋亡的影響 與H9c2組比較，哈巴苷組細胞凋亡率無明顯變化，H2O2組細胞凋亡率明顯升高 (P< 0.05)；與H2O2組比較， H2O2+ 哈巴苷組細胞凋亡率顯著降低 (P< 0.05)，表明哈巴苷能抑制H2O2誘導的細胞凋亡。詳見圖3。

2.3 哈巴苷對凋亡蛋白表達的影響 與H9c2組比較，H2O2組細胞Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)，Bax表達水平明顯升高 (P< 0.05)；與H2O2組比較，H2O2+ 哈巴苷組細胞Bcl-2表達明顯增多，Bax表達顯著減少 (P< 0.05)。詳見圖4。H2O2還能顯著促進H9c2細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達 (P< 0.05)，能顯著減弱H2O2誘導Caspase-3和Caspase-9表達的作用 (P<0.05)，表明哈巴苷能對抗H2O2誘導的心肌細胞凋亡。詳見圖5。

2.4 哈巴苷對氧化應激的影響 H2O2組H9c2細胞的DCF熒光強度與H9c2組比較明顯升高 (P<0.05)，表明H2O2能誘導ROS的產(chǎn)生；H2O2+ 哈巴苷組細胞DCF熒光強度明顯低于H2O2組 (P<0.05)，表明哈巴苷能減弱H2O2誘導ROS產(chǎn)生的作用。與H9c2組比較，哈巴苷組細胞上清液SOD、MDA和GSH的含量無明顯變化，H2O2組細胞上清液SOD和GSH的濃度明顯降低 (P< 0.05)，MDA濃度明顯升高 (P< 0.05)；H2O2+ 哈巴苷組細胞上清液SOD和GSH含量與H2O2組比較顯著升高 (P< 0.05)，MDA濃度明顯降低 (P< 0.05)，提示哈巴苷能抑制H2O2誘導的氧化應激，從而抑制心肌細胞凋亡。詳見圖6、圖7。

3 討 論

既往研究認為，細胞壞死是心肌損傷的主要方式，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡也是心肌細胞損傷的另一主要方式[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，心臟病病人心肌受損的中心區(qū)域和周圍組織均出現(xiàn)了大量的心肌細胞凋亡，表明心肌凋亡也是導致心肌梗死的主要原因之

一[10]。因此，抑制心肌細胞凋亡是治療心血管疾病的關(guān)鍵。近年來研究表明，多類中藥提取物都具有心肌保護作用。蛇床子提取物蛇床子素能抑制阿霉素誘導的心肌細胞凋亡[11]，川芎提取物能通過抑制心肌細胞凋亡提高心力衰竭大鼠的心臟功能[12]。哈巴苷是白毛夏枯草的主要活性成分，能通過促進GSH表達，抑制一氧化氮的分泌抑制神經(jīng)元細胞氧化應激，減少神經(jīng)元的凋亡[8]，但其對心肌細胞的作用還未見報道。

H2O2是一類ROS，常被用于誘導心肌缺血和心肌缺血再灌注等心血管疾病模型[13]。研究表明，ROS可通過抑制Bcl-2表達，并促進Bax轉(zhuǎn)移至線粒體誘導細胞色素C的釋放，從而上調(diào)Caspase家族蛋白的表達，啟動線粒體細胞凋亡程序[13]。Caspase家族蛋白是細胞凋亡的最終執(zhí)行者，其中Caspase-3和Caspase-9是細胞凋亡的最重要調(diào)控分子[14]。因此，本研究采用H2O2處理心肌H9c2細胞發(fā)現(xiàn)，H2O2能顯著抑制心肌細胞增殖并能促進心肌細胞H9c2凋亡，誘導Caspase-3和Caspase-9的表達。哈巴苷具有顯著減弱H2O2抑制心肌細胞增殖、誘導心肌細胞凋亡的作用，并能抑制Caspase-3和Caspase-9的表達。此外，H2O2還能明顯上調(diào)H9c2細胞Bax的表達水平，降低Bcl-2的表達水平，哈巴苷能顯著減弱H2O2對Bcl-2和Bax表達的調(diào)控作用，提示哈巴苷能對抗H2O2誘導的心肌細胞凋亡。

與H9c2組比較，*P 0.05；與H2O2組比較，#P 0.05圖3 哈巴苷對心肌細胞H9c2凋亡的影響

與H9c2組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖4 哈巴苷對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

與H9c2組比較，*P 0.05；與H2O2組比較，#P 0.05圖5 哈巴苷對H9c2細胞Caspase-3和Caspase-9表達的影響

與H9c2組比較，*P0.05與H2O2組比較，#P 0.05圖6 哈巴苷對ROS表達的影響

與H9c2組比較，*P 0.05；與H2O2組比較，#P 0.05圖7 哈巴苷對H9c2細胞SOD、GSH和MDA分泌的影響

氧化應激損傷是導致心肌細胞凋亡的主要原因之一。在慢性心力衰竭、心肌缺血等許多心血管疾病中均會出現(xiàn)氧化應激損傷[15]。ROS是誘導氧化應激的主要活性分子，主要由線粒體分泌產(chǎn)生[16]。ROS可直接導致線粒體膜破壞，使線粒體膜通透性增加，出現(xiàn)水腫，直接導致細胞凋亡程序的啟動[17]。同時ROS還能抑制抗氧化酶的產(chǎn)生。已有研究表明，ROS直接導致心肌細胞凋亡和壞死[18]。因此，有效地抑制氧化應激將有利于心血管疾病的治療。H2O2能通過促進線粒體細胞色素C的釋放誘導凋亡基因的表達，從而促進細胞凋亡[2]。本研究采用DCF-DA法檢測了H9c2細胞內(nèi)ROS活性，實驗結(jié)果表明，H2O2作用于H9c2細胞能顯著提高細胞內(nèi)ROS的活性，提示H2O2能誘導H9c2細胞氧化應激。哈巴苷能顯著減弱H2O2對ROS活性的誘導作用，提示哈巴苷具有一定的抗氧化損傷活性。MDA是典型的細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，與細胞損傷程度呈正相關(guān)；SOD是一類抗氧化酶，GSH是人體內(nèi)重要的還原劑，兩者均能清除細胞內(nèi)的ROS，從而減輕細胞氧化應激損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能顯著抑制抗氧化酶SOD和還原酶GSH分泌，促進MDA的分泌，進一步表明H2O2能誘導H9c2細胞氧化應激，哈巴苷能顯著降低細胞上清液中MDA濃度，升高SOD和GSH濃度，同時還能抑制ROS的產(chǎn)生，表明哈巴苷具有抗心肌細胞氧化應激的能力，從而抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，哈巴苷能抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡率，降低凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達水平，并能促進凋亡抑制基因Bcl-2的表達，同時還能升高細胞上清液中SOD和GSH的濃度，降低MDA濃度并抑制細胞內(nèi)ROS的活性，表明哈巴苷能通過抑制氧化應激抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮細胞保護作用。本研究探究了哈巴苷對氧化應激誘導的心肌細胞凋亡的作用，以期為心血管疾病的治療提供新的潛力藥物依據(jù)。