電針曲池、足三里對缺血再灌注大鼠缺血側(cè)運動皮層小膠質(zhì)細胞與外泌體蛋白的影響及機制

金婷婷，柳維林，李鉆芳，李建鴻，張嘉泳，李樂，張宇豪，陳立典，5，陶靜，5

腦卒中是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因之一，約75%的幸存者因腦卒中導致殘疾，運動功能障礙是腦卒中后殘疾的主要的功能障礙表現(xiàn)之一[1-2]。小膠質(zhì)細胞的激活和極化在腦損傷后神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用，具有不同的表型并發(fā)揮不同的功能[3]。研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥疾病，可以通過外泌體調(diào)節(jié)外周免疫反應[4]。M2型小膠質(zhì)細胞衍生的外泌體可以通過控制釋放炎性細胞因子，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應[5]。通過團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，電針曲池和足三里穴可以促進缺血性腦卒中后運動功能障礙的恢復[6-7]。因此本研究通過電針缺血再灌注大鼠的曲池、足三里穴觀察其是否通過影響小膠質(zhì)細胞衍生的外泌體的分泌，進而改善大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能缺損癥狀及運動功能障礙。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：36只SPF級雄性 Sprague-Dawley大鼠，購于上海斯萊克實驗動物責任有限公司，體質(zhì)量(280±20) g，生產(chǎn)許可證號 SCXK(滬)2012-0002。由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，其許可證號為：SYXK(閩)2005-004。環(huán)境及飲食符合實驗動物標準，每籠5～6只，適應性喂養(yǎng)1周后，進行造模和干預。所有動物方案均根據(jù)實驗動物使用指南(National Academy Press)進行。②主要試劑和儀器 ：G6805電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；免疫組化試劑盒(邁新公司)；CD81一抗(Cell Signaling Technology 公司)；Arginase一抗(ABCAM公司)；Catwalk XT 10.0(荷蘭Noldus Information Technology公司)；萊卡DM4000B LED倒置顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.2 方法 ①造模與分組：將36只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和電針組各12只。模型組和電針組參考改良Koizumi法制備左側(cè)大腦缺血再灌注動物模型[8]，術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3.0%異氟烷麻醉并固定。將頸部皮膚中央縱向剪開約2cm，肌肉和結(jié)締組織解離暴露左側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈。結(jié)扎左側(cè)頸總、頸外動脈，將頸內(nèi)動脈近心端預留結(jié)扎線，微動脈夾暫時夾閉左側(cè)頸內(nèi)動脈；將線栓從左側(cè)頸總動脈結(jié)扎處遠端3 mm處插入，直至大腦前動脈近端，從頸外動脈的殘端沿頸內(nèi)動脈插入(18±2) cm深；結(jié)扎左側(cè)頸內(nèi)動脈上預留的線并固定線栓；縫合皮膚，檢查、清洗手術(shù)創(chuàng)口；90min后退出線栓，造成缺血再灌注模型。假手術(shù)組只分離頸總、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，不予結(jié)扎動脈和線栓插入。將造模后大鼠置于 25℃環(huán)境下蘇醒，術(shù)中、術(shù)后均注意保暖。②干預方法： 電針組大鼠穴位參考《實驗針灸學》[9]，取曲池、足三里穴。采用華佗牌30號0.5寸毫針，斜刺0.2cm左右。接G6805電針儀，疏密波，頻率2～20 Hz，電流強度1～3 mA。每次0.5h，每天1次，電針7 d。假手術(shù)組和模型組每天同一時間同等條件抓取后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療。

1.3 檢測指標 ①神經(jīng)功能缺損評估：采取Zea-Longa法在造模2h后對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，評分為0～4分。 0分，無神經(jīng)功能缺損體征；1分，對側(cè)前爪不能完全伸展； 2分，向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈； 3分，行走時向偏癱側(cè)傾倒； 4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。 ②Catwalk測試：測試前采用Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)進行1周的適應性訓練[10]。各組大鼠在電針治療7d 后，經(jīng)神經(jīng)行為學評分完成后接受 Catwalk系統(tǒng)步態(tài)分析，整個實驗過程在暗室環(huán)境中完成，每次必須持續(xù)地穿過固定長度范圍的玻璃平板，該系統(tǒng)在可以從速度、持續(xù)時間、爪印面積等方面檢測大鼠得分肢體運動功能障礙的改變情況。③免疫組化染色：各組大鼠在行為學檢測后灌注取腦，制備5μm冠狀切片。經(jīng)過脫蠟、梯度酒精脫水，檸檬酸抗原修復后，滴加3%H2O2常溫孵育10min；PBS漂洗3次； 10%山羊血清常溫封閉10min；滴加一抗Arginase(1∶200)，于濕盒中 4°C 過夜；室溫中復溫 30 min，滴加生物素標記二抗，室溫孵育10min，PBS漂洗3次；滴加鏈霉卵白素-過氧化物酶，室溫10min；PBS漂洗3次;滴加DAB 顯色劑，蘇木素染色后返藍、封片。結(jié)合細胞構(gòu)筑信息，并參考大鼠腦定位圖譜，確定運動皮層的位置。每只老鼠選取6個視野使用Motic Med 6.0 病理圖像分析系統(tǒng)，計算陽性率(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))。④免疫熒光染色：組織切片后使用檸檬酸修復，5%胎牛血清封閉后室溫孵育2h。依據(jù)分組加入兔抗 Argnise多克隆抗體 (1:100, Abcam)、鼠抗CD81多克隆抗體(1:20, Abcam)，于濕盒中4°C過夜；室溫復溫30min，分別加入羊抗兔熒光二抗(1:500, invitrogen)，和羊抗鼠熒光二抗(1:500, invitrogen)，37°C孵育2h，PBS 漂洗3次。使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片后用德國萊卡免疫熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)陽性細胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠 Zea-longa神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果比較 與假手術(shù)組相比，造模后2h，模型組和電針組Zea-longa神經(jīng)功能缺損評分明顯升高(P<0.01)。電針干預7 d后，電針組相比模型組Zea-longa神經(jīng)功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。見表1。

組別n缺血再灌注后2h缺血再灌注后7d假手術(shù)組1200模型組122.83±0.58a2.34±0.43電針組122.92±0.51a1.58±0.52b

與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

2.2 電針曲池、足三里穴對動物整體行為學的影響 干預7d后，Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)顯示，模型組相比假手術(shù)組及電針組大鼠穿過Catwalk 跑道的平均速度減慢(P<0.01)，而持續(xù)時間增加(P<0.01)，爪印面積(左前爪LF、左后爪LH、右前爪 RF；右后爪RH)減少 (P<0.05)；電針組相比模型組大鼠平均速度增快(P<0.01)，持續(xù)時間減少(P<0.05)，爪印面積明顯增加(左前爪LF、左后爪LH、右前爪RF、右后爪RH)(P<0.01)，見表2，3。

組別n平均速度(cm/s)持續(xù)時間(s)假手術(shù)組1215.60±1.162.15±0.30模型組126.17±1.06a5.79±0.58a電針組129.37±0.94ab3.34±0.85ac

與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

組別n左前爪LF左后爪LH右前爪RF右后爪RH假手術(shù)組120.71±0.040.87±0.080.68±0.130.86±0.07模型組120.57±0.18a0.78±0.06a0.44±0.77a0.52±0.22a電針組120.63±0.07ab0.80±0.04ab0.53±0.12ab0.79±0.08ab

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.01

2.3 3組大鼠缺血側(cè)運動皮層M2型小膠質(zhì)細胞情況比較 干預7d后，采用免疫組化法檢測缺血側(cè)運動皮層Argnise的陽性率，結(jié)果表明電針組Argnise的表達明顯比模型組增多(P<0.01)。見圖1a～c，表4。

a.假手術(shù)組 b.模型組 c.電針組

圖1a～c 干預7d后3組大鼠缺血側(cè)運動皮層Argnise表達(免疫組化染色200倍)

2.4 3組大鼠缺血側(cè)運動皮層小膠質(zhì)細胞分泌的外泌體情況比較 干預7d后，采用免疫熒光法檢測缺血側(cè)皮層小膠質(zhì)細胞衍生的外泌體CD81的表達，結(jié)果表明，模型組和電針組Argniseey及缺血側(cè)運動皮層CD81/Argnise陽性細胞數(shù)多于假手術(shù)組(P<0.01)，且電針組缺血側(cè)運動皮層 CD81/Argnise陽性細胞數(shù)多于模型組(P<0.01)。CD81在假手術(shù)組中分泌于未極化狀態(tài)的M2型小膠質(zhì)細胞表面，模型組和電針組分泌于腦卒中后極化狀態(tài)下的M2型小膠質(zhì)細胞表面。見圖2a～c，表4。

組別nArgniseCD81/Argnise假手術(shù)組40.19±0.064.75±0.96模型組40.37±0.83a16.75±8.06a電針組40.68±0.04ab48.50±1.91ab

與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖2a～c 干預7d后3組大鼠缺血側(cè)運動皮層CD81/Argnise表達(免疫熒光染色200倍)

3 討論

腦卒中屬于中醫(yī)學“中風”范疇，中醫(yī)認為以陽氣經(jīng)氣受阻，經(jīng)脈失其所養(yǎng)而致。故治療原則當以調(diào)整氣血、平衡陰陽、疏通經(jīng)脈為主。《內(nèi)經(jīng)》明確指出針灸可以作為治療中風的有效方法之一。本課題組通過前期文獻梳理，發(fā)現(xiàn)曲池、足三里穴在古籍中為中風病治療的常用的穴位。本研究也發(fā)現(xiàn)電針曲池、足三里穴可以通過增加小膠質(zhì)細胞衍生的外泌體的分泌，有效改善缺血再灌注大鼠運動功能，緩解缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損。

小膠質(zhì)細胞占總神經(jīng)膠質(zhì)細胞總數(shù)的20%，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐吞噬細胞，主要功能是維持腦組織穩(wěn)態(tài)，在缺血再灌注損傷中小膠質(zhì)細胞也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[11]。小膠質(zhì)細胞又分為M1(促炎)和M2(抗炎)細胞，促炎癥表型旨在保護和修復CNS免受損傷，然而在神經(jīng)系統(tǒng)中過度和長期的神經(jīng)炎癥可能會加重腦損傷。 M2表型可選擇活化狀態(tài)，抑制炎癥并且有效恢復體內(nèi)平衡[12]。外泌體作為納米囊泡(直徑約30～100 nm)的一種，通過遞送蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸靶向細胞功能，正在成為疾病階段特異性信息的寶貴來源，并作為不同病理生理狀態(tài)下的潛在生物標志物[13]，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。外泌體中含有促炎和抗炎信號，可以作為治療中風的有效載體[14]。小膠質(zhì)細胞衍生的外泌體含有各種生物活性分子，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能并且影響周圍非神經(jīng)元細胞的活性，可以通過將未成熟的IL-1β轉(zhuǎn)化為生物活性分子調(diào)節(jié)急性炎癥反應[15]。

本課題證實電針曲池、足三里穴能夠顯著改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，增加了M2型小膠質(zhì)細胞的的數(shù)量，并且促進M2型小膠質(zhì)細胞外泌體的表達，促進運動功能的恢復。綜上所述，電針曲池、足三里穴可以有效地改善缺血再灌注大鼠改善大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能缺損癥狀及運動功能障礙，其作用可能與增加M2型小膠質(zhì)細胞衍生的外泌體的分泌有關(guān)，但電針如何促進外泌體分泌的機制尚未明確，在今后的研究中應予以深入研究。