hBDNF轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞對腦外傷大鼠的神經(jīng)保護作用

徐忠燁，胡永珍，張立陽，李曉娜，李雪松

(惠州市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 惠州 516002)

創(chuàng)傷性腦外傷常常引起神經(jīng)細胞大量的死亡和嚴重的神經(jīng)功能障礙，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞不足以有效地重建損傷的結(jié)構(gòu)和恢復(fù)神經(jīng)功能。因此，移植轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷具有廣闊的應(yīng)用前景，一方面其分泌的外源性細胞因子可以改善損傷局部的微環(huán)境為損傷組織提供營養(yǎng)支持；另一方面神經(jīng)干細胞可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)良好地整合，參與神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建[1]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)是最為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，在促進神經(jīng)元存活和防止損傷后神經(jīng)細胞退行性病變等方面具有重要的作用[2-3]。本研究擬通過移植穩(wěn)定表達外源性hBDNF基因的神經(jīng)干細胞治療創(chuàng)傷性腦外傷大鼠，并探討可能的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料細胞培養(yǎng)基和各種細胞因子為Sigma公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，TUNEL試劑盒為Roche公司產(chǎn)品。穩(wěn)定表達hBDNF和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞為本實驗室自行制備及凍存， hBDNF ELISA檢測試劑盒為北京晶美公司產(chǎn)品。引物的設(shè)計與合成：hBDNF擴增上游引物為5'GACATCATTGGCTGACACTTTCG3',下游引物為5'ATGGGATTGCACTTGGTCTCGTA3'，引物擴增產(chǎn)物長度為399bp；內(nèi)參基因GAPDH的擴增上游引物為5'GAAGGTCGGAGTCAACGG3'，下游引物為5'GGAAGATGGTGATGGGATT3'，引物擴增產(chǎn)物長度為221bp。

1.2 細胞的復(fù)蘇與擴增將凍存的細胞快速溶解后接種于含bFGF 20ng/mL，EGF 20ng/mL，1% N2和2% B27的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，3～4d換液一次，7d傳代一次。移植前利用流式細胞儀檢測細胞表達EGFP的比率，利用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)檢測轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞表達外源性hBDNF基因的情況，具體過程包括：由細胞或組織提取總RNA，與試劑盒中的DEPC H2O和Oligo(dT)混合后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA；取2μL cDNA與上下游引物、Taq酶、dNTP和PCR buffer混合至50μL總體積后進行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察結(jié)果，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3 動物模型制備成年雄性Wistar大鼠75只由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，采用改進的Feeney’s自由落體硬膜外撞擊方法制備腦外傷大鼠模型，撞擊位置為右側(cè)前囟后3mm，中線旁2mm，將外傷后的大鼠分為3組(每組25只)：Ⅰ組(對照組)，注射PBS；Ⅱ組，移植神經(jīng)干細胞；Ⅲ組，移植轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞。具體移植方法和位置：外傷后24h，在傷側(cè)前囟后3mm和中線旁開1.1mm處分別在大腦皮層下2mm和4mm移植10μL PBS或細胞懸液(大約1×106個細胞)，每點移植5μL。

1.4 轉(zhuǎn)基因細胞在體內(nèi)的存活及hBDNF的表達分別在移植后的1周和4周于各組隨機選取大鼠，取腦固定后，由注射點前后連續(xù)制備冰凍切片，切片厚20μm，并在共聚焦顯微鏡下觀察EGFP陽性細胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化。在移植后0d(傷后24h)、3d、1周、2周、3周和4周由各組中隨機選取大鼠，取損傷灶及周邊的腦組織200mg，應(yīng)用RT-PCR和ELISA法檢測hBDNF在腦內(nèi)的表達。

1.5 各腦區(qū)細胞凋亡分析分別取移植后0d和移植后1周、2周、3周和4周的腦組織冰凍切片，應(yīng)用TUNEL法檢測神經(jīng)細胞的凋亡。凋亡結(jié)果分析：取5張切片，在顯微鏡下觀察，定量計數(shù)每張切片內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)量。

1.6 神經(jīng)功能評分(Neurological Serverity Scores，NSS)移植細胞后0d、1周、2周、3周和4周，由每組動物隨機選取5只大鼠進行NSS評分，NSS評分包括運動功能、感覺功能、平衡能力和反射能力的測試，評分采用雙盲法。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以SPSS 18.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準差”表示，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細胞的復(fù)蘇和檢測凍存的神經(jīng)干細胞和轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞在復(fù)蘇后7d均可以形成細胞克隆，轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞表達EGFP(圖1)，而非轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞無EGFP表達(圖2)，將這些細胞克隆傳代2周后可見大量的神經(jīng)干細胞克隆形成(圖3、>4)，應(yīng)用流式細胞儀分析可見神經(jīng)干細胞基本無EGFP表達，而轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞接近百分百的表達EGFP(圖5)。RT-PCR分析表明(圖6)，神經(jīng)干細胞無hBNDF基因表達，而轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞表達hBDNF基因。上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞經(jīng)過復(fù)蘇后仍可以穩(wěn)定地表達外源性基因，符合我們實驗的需要。

圖1 復(fù)蘇后EGFP陽性的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞經(jīng)克隆(×200)

圖2 復(fù)蘇后的神經(jīng)干細胞克隆(×200)

圖3 轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞傳代后形成大量的

圖4 神經(jīng)干細胞傳代后形成大量的細胞克隆(×100)

圖5 FACS分析表明98.84%的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞為EGFP陽性細胞，而神經(jīng)干細胞為EGFP陰性細胞

圖6 RT-PCR結(jié)果表明神經(jīng)干細胞不表達外源性的hBDNF基因，而轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞表達外源性的hBNDF基因

2.2 轉(zhuǎn)基因細胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化移植后1周和4周在激光共聚焦顯微鏡下均可以觀察到EGFP陽性細胞，移植后1周既可以觀察到一些細胞由移植點向損傷區(qū)域遷移，而4周后可以觀察到在病灶周邊有大量的EGFP陽性細胞，并表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的形態(tài)，具有明顯的軸突和樹突(圖7、圖8)，說明移植細胞可以在宿主體內(nèi)長期存活、遷移及分化。

圖7 移植到體內(nèi)1周后可見EGFP陽性轉(zhuǎn)基因細胞的遷移(白色箭頭方向)。Scar=300μm

圖8 移植4周后，病灶周圍可見大量EGFP陽性轉(zhuǎn)基因細胞分化而來的具有明顯成熟神經(jīng)元形態(tài)的細胞(白色箭頭)。Scar=150μm

2.3 hBDNF在體內(nèi)的表達RT-PCR結(jié)果表明在移植后的較長時間內(nèi)(3d～4周)，轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞可以持續(xù)性地表達外源性hBDNF基因，隨時間的推移表達水平有所下降，但是在4周后仍可見明顯的hBDNF表達(圖9)。

圖9 移植后損傷周邊區(qū)域內(nèi)外源性hBDNF mRNA表達的RT-PCR分析

注：1為對照組

ELISA檢測結(jié)果表明在移植后3d、1周、2周、3周和4周時，hBDNF在損傷局部的濃度分別是(4.24±0.52)、(5.12±0.63)、(3.4±0.73)、(3.22±0.58)、(2.56±0.45)ng/mg(總蛋白)，變化趨勢基本與PR-PCR結(jié)果相同，說明轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞可以在較長時間內(nèi)分泌外源性的hBDNF。

2.4 細胞凋亡數(shù)量分析TUNEL檢測結(jié)果表明，外傷后24h打擊區(qū)域就有大量的細胞凋亡，各組間無明顯差異。在Ⅰ組與Ⅱ組中，損傷后1周凋亡數(shù)量最高，隨后凋亡數(shù)量下降，盡管在1周時Ⅱ組細胞凋亡數(shù)量少于Ⅰ組，但是無統(tǒng)計學(xué)差異，從2周以后Ⅱ組凋亡細胞數(shù)量開始明顯低于Ⅰ組。與Ⅱ組相比，Ⅲ組從移植1周后開始各時間點細胞凋亡數(shù)量明顯降低(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組從移植1周后開始細胞凋亡數(shù)量降低更為明顯(P<0.01)，如表1。

表1 病灶周邊細胞凋亡數(shù)量分析

注：在同一時間Ⅱ組與Ⅰ組比較，*P<0.05；Ⅲ組與Ⅰ組比較**P<0.01；Ⅲ組與Ⅱ組比較，#P<0.05。

2.5 大鼠神經(jīng)功能的影響各組大鼠外傷后24h NSS評分均較高，說明創(chuàng)傷性腦外傷造成大鼠嚴重的神經(jīng)功能障礙。Ⅱ組與Ⅰ組相比，從移植2周后開始NSS評分明顯降低(P<0.05)；Ⅲ組和Ⅰ組相比，從移植1周后開始NSS評分明顯降低(P<0.01)；Ⅲ組和Ⅱ組相比，從移植1周后開始NSS評分明顯降低(P<0.05)，如表2。

表2 細胞移植后腦外傷大鼠的NSS評分

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；**P<0.01。與Ⅱ組比較，#P<0.05。

3 討論

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞，具有自我更新和向多種神經(jīng)細胞分化的潛能[4]。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為移植外源性細胞替代各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的細胞損傷/壞死，促進神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)開辟了一個新的領(lǐng)域[5]。此外，神經(jīng)干細胞還是一種優(yōu)秀的外源性基因載體，對于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義[6]。

本研究結(jié)果表明，復(fù)蘇后的神經(jīng)干細胞和轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞可以在體外迅速地增殖，傳代后可以形成大量的細胞克隆，提示神經(jīng)干細胞和轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞經(jīng)過凍存和復(fù)蘇后其自我更新能力無明顯變化。為了追蹤外源性細胞在宿主體內(nèi)的存活、遷移和分化等，需要在細胞移植前對其進行合適的標(biāo)記，現(xiàn)有的各種示蹤技術(shù)包括Brdu標(biāo)記法、Hoechst標(biāo)記法、轉(zhuǎn)染LacZ基因、轉(zhuǎn)染EGFP基因等方法[7]。在本研究中我們使用的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞可以穩(wěn)定地表達EGFP，EGFP的熒光強度很高，作為報告基因容易被儀器定量檢測，并且在與目的基因連接后，可通過光學(xué)設(shè)備觀察和檢測外源性基因在細胞中的表達[8]。本研究的FACS結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞幾乎都可以表達EGFP，移植到大鼠腦內(nèi)后，這些轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞可以持續(xù)長時間地表達EGFP，這些EGFP充滿了細胞的胞體和突起。在移植1周時我們除了可以觀察到大量EGFP陽性細胞在宿主腦內(nèi)存活外，還可以發(fā)現(xiàn)由移植區(qū)域向損傷區(qū)域的“細胞遷移流”，這些細胞尚未到達損傷區(qū)域，在“細胞遷移流”中部分細胞可見分化出明顯的胞體和突起。移植4周后，我們?nèi)钥梢杂^察到大量的EGFP陽性細胞，部分細胞表現(xiàn)出成熟神經(jīng)細胞的形態(tài)，具有典型的軸突和樹突。因此EGFP不僅可以用于示蹤細胞，便于我們研究細胞在體內(nèi)存活和遷移，還可以間接地反應(yīng)出細胞分化狀態(tài)。

創(chuàng)傷性腦外傷除了造成嚴重的原發(fā)性損傷外，隨后發(fā)生的繼發(fā)性損傷將在一段時間內(nèi)持續(xù)，在7d左右達到高峰，在損傷局部會出現(xiàn)的多種有害因素還可以通過旁觀者效應(yīng)損傷與損傷灶相鄰的神經(jīng)組織或細胞，擴大神經(jīng)功能障礙[9-10]。在本研究中，TUNEL計數(shù)和NSS評分結(jié)果證明外傷后24h在各組大鼠損傷灶周邊即出現(xiàn)大量凋亡的神經(jīng)細胞，NSS評分在13～14分之間(NSS評分在13～18為重度損傷、7～12為中度損傷、1～6為輕度損傷)，證明腦外傷大鼠產(chǎn)生了嚴重的神經(jīng)功能障礙。外傷后1周左右時在Ⅰ組和Ⅱ組中細胞凋亡達到高峰，NSS評分增加，而在Ⅲ組中細胞凋亡數(shù)量和NSS評分均下降。這些結(jié)果提示，原發(fā)性損傷后繼發(fā)性損傷可以加重神經(jīng)功能障礙，在1周左右時達到高峰，移植的神經(jīng)干細胞在1周時尚未發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護作用，這可能與此階段的移植細胞正在向損傷區(qū)域遷移，尚未參與損傷的重建和神經(jīng)的保護作用，而轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞則在移植后1周時就可以發(fā)揮了神經(jīng)保護作用，這可能與其分泌的hBDNF參與了神經(jīng)保護作用有關(guān)。

神經(jīng)細胞的存活和生長離不開多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激，在病理情況下施加外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子會明顯地促進神經(jīng)細胞存活和再生，改善宿主的神經(jīng)功能障礙。因為繼發(fā)性損傷將在較長的一段時間內(nèi)存在，因此只有移植穩(wěn)定表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的外源性細胞才能確實有效地產(chǎn)生保護作用[11]。BDNF在促進成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活和防止損傷后神經(jīng)細胞退行性病變等方面具有重要的作用[12]，然而在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其含量極微，盡管在損傷后有一過性的表達增加，但維持時間較短，并且血腦屏障阻礙了從循環(huán)途徑應(yīng)用的BDNF，因此極大地限制了BDNF在治療中的應(yīng)用[13]。為了解決上述問題，我們在前期工作中制備了可以穩(wěn)定表達hBNDF的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞。在本研究中，RT-PCR檢測證實復(fù)蘇的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞，擴增后仍可以表達hBDNF，移植后，腦組織的RT-PCR和ELISA檢測表明這些轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞在體內(nèi)可以長期地表達hBDNF，將損傷局部的hBDNF維持在較高水平。TUNEL和NSS評分結(jié)果顯示，在細胞移植1周后，與Ⅱ組大鼠相比，Ⅲ組大鼠損傷病灶周邊的細胞凋亡數(shù)量明顯下降，NSS評分也明顯下降，說明轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞分泌的hBDNF對病灶周圍的神經(jīng)細胞產(chǎn)生了明確的保護作用，進而促進了大鼠神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)。

總之，我們的研究表明，hBDNF轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞可以在體內(nèi)長期、存活及分化，分泌的hBDNF可以直接作用于神經(jīng)細胞產(chǎn)生明確的保護作用，促進腦外傷大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究的成功將為進一步利用轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病/損傷奠定一定的理論和實踐基礎(chǔ)。