不同產(chǎn)地苦杏仁藥材及其飲片水提液HPLC指紋圖譜研究

胡祥昊,李亞男，孫志強(qiáng)，高鵬，代龍*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355; 2.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200)

苦杏仁為薔薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim、西伯利亞杏PrunussibiricaL.、東北杏Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne或杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟種子[1],有降氣止咳平喘、潤(rùn)腸通便的功效，主要含苦杏仁苷、脂肪、蛋白質(zhì)和多種微量元素[2-3]，其中苦杏仁苷口服進(jìn)入體內(nèi)后，在β-葡萄糖苷酶的作用下生成氫氰酸，為鎮(zhèn)咳、平喘的主要藥效成分，同時(shí)也是苦杏仁的毒性成分[4-5]。目前已有甲醇超聲提取苦杏仁藥材用于指紋圖譜研究的相關(guān)報(bào)道[6]，而古代典籍中經(jīng)典名方大部分采用水煎煮[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用苦杏仁藥材水提液進(jìn)行指紋圖譜研究,并對(duì)比分析生杏仁與燀杏仁的指紋圖譜，闡明苦杏仁炮制過(guò)程中有效成分的傳遞關(guān)系，旨在為含苦杏仁的制劑指紋圖譜研究提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津制作所)；十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用15批苦杏仁藥材由安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司提供，采購(gòu)于山西省運(yùn)城市萬(wàn)榮縣等3個(gè)不同產(chǎn)地，見(jiàn)表1，經(jīng)濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師宋希貴鑒定為薔薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim的干燥種子；苦杏仁苷對(duì)照品(批號(hào)：110820-201808)采購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈均為色譜純。

表1 苦杏仁藥材來(lái)源信息

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

采用Kinetex C18(2.6 μm, 100 mm×4.6 mm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速0.6 mL·min-1, 柱溫20 ℃，進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相梯度洗脫比例見(jiàn)表2。

表2 HPLC梯度洗脫程序表

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取苦杏仁苷對(duì)照品10.00 mg，置25 mL容量瓶中，加HPLC級(jí)甲醇定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品母液。精密量取1 mL母液置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 燀杏仁的制備

取苦杏仁藥材，除去雜質(zhì)。加10倍量水，煮沸后將苦杏仁倒入沸水中，燀制10 min，撈出，放入冷水中，除去種皮，60 ℃烘干[8]。

2.4 供試品溶液的制備

稱(chēng)取苦杏仁粉末(過(guò)二號(hào)篩)約1.0 g，置圓底燒瓶中，加水50 mL， 置電熱套上回流1 h，加水補(bǔ)足減重，趁熱濾過(guò)，續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾頭，即得。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 精密度

取同一批苦杏仁藥材供試品溶液，按2.1項(xiàng)下液相條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見(jiàn)圖1。以圖6b中7號(hào)峰為參照峰，結(jié)果7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明儀器精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性

取同一批苦杏仁藥材供試品溶液，按2.1項(xiàng)下液相條件分別在0、3、6、9、12、15 h進(jìn)樣6次，結(jié)果見(jiàn)圖2。7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明15 h內(nèi)苦杏仁藥材供試品穩(wěn)定性良好。

圖2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.2 Chromatogram matching results of the stability test

3.3 重復(fù)性

取同一批苦杏仁藥材粉末稱(chēng)取6份，按2.4項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明該方法重復(fù)性較好。

圖3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.3 Chromatogram matching results of the repeatability test

3.4 參照峰的選擇

取15批不同產(chǎn)地的苦杏仁藥材，按照2.4項(xiàng)下樣品制備方法平行制備15批樣品，并依次按2.1項(xiàng)下液相條件進(jìn)行指紋圖譜分析，對(duì)比15批藥材的7個(gè)共有峰，發(fā)現(xiàn)7號(hào)峰分離度較好且具有較大的峰面積，因此選擇7號(hào)峰作為參照峰。

3.5 指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

通過(guò)對(duì)15批不同產(chǎn)地苦杏仁藥材的指紋圖譜色譜峰進(jìn)行分析，共確定了14個(gè)共有峰，其中7個(gè)共有峰(圖6b)峰形較好，且分離度大于1.5，因此選取7個(gè)峰作為共有指紋峰進(jìn)行方法學(xué)考察。分別計(jì)算7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，符合指紋圖譜的要求。運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算可知[9]，15批苦杏仁指紋圖譜(圖4)相似度在0.97～0.99之間(表3)，表明各批次樣品之間具有較高的相似度，不同產(chǎn)地的苦杏仁藥材指紋圖譜差別不大。

圖4 15批苦杏仁藥材指紋圖譜Fig.4 Fingerprint chromatogram of 15 batches of Semen Armeniacae Amarae

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15RS11.0000.9980.9940.9460.9760.9420.9300.9300.9240.9280.9260.9721.0000.9980.9940.982S20.9981.0000.9980.9570.9780.9540.9360.9330.9270.9320.9300.9300.9981.0000.9980.985S30.9940.9981.0000.9610.9740.9550.9380.9320.9260.9320.9320.9280.9940.9981.0000.985S40.9460.9570.9611.0000.9360.9950.9690.9570.9560.9620.9610.9650.9460.9570.9610.981S50.9760.9780.9740.9361.0000.9300.9270.9280.9230.9260.9250.9220.9760.9780.9740.974S60.9420.9540.9550.9950.9301.0000.9610.9510.9470.9530.9530.9630.9420.9540.9550.976S70.9300.9360.9380.9690.9270.9611.0000.9960.9950.9870.9860.9830.9300.9360.9380.980S80.9300.9330.9320.9570.9280.9510.9961.0000.9990.9880.9870.9830.9300.9330.9320.978S90.9240.9270.9260.9560.9230.9470.9950.9991.0000.9900.9900.9840.9240.9270.9260.975S100.9280.9320.9320.9620.9260.9530.9870.9880.9901.0000.9990.9840.9280.9320.9320.977S110.9260.9300.9320.9610.9250.9530.9860.9870.9900.9991.0000.9850.9260.9300.9320.976S120.9270.9300.9280.9650.9220.9630.9830.9830.9840.9840.9851.0000.9270.9300.9280.975S131.0000.9980.9940.9460.9760.9420.9300.9300.9240.9280.9260.9271.0000.9980.9940.982S140.9981.0000.9980.9570.9780.9540.9360.9330.9270.9320.9300.9300.9981.0000.9980.985S150.9940.9981.0000.9610.9740.9550.9380.9320.9260.9320.9320.9280.9940.9981.0000.985R0.9980.9850.9850.9810.9740.9760.9800.9780.9750.9770.9760.9750.9820.9850.9851.000

3.6 生杏仁與燀杏仁HPLC指紋圖譜比較

取15批不同產(chǎn)地的苦杏仁藥材，按照2.3項(xiàng)下制備方法制備15批燀杏仁，并按照2.4項(xiàng)下樣品制備方法平行制備15批樣品，依次按2.1項(xiàng)下液相條件進(jìn)行指紋圖譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

通過(guò)對(duì)苦杏仁藥材與燀杏仁的HPLC指紋圖譜分析(圖6)，結(jié)果顯示5、6號(hào)峰(圖6b)為生杏仁和燀杏仁的共有峰，且燀杏仁中苦杏仁苷含量遠(yuǎn)大于生杏仁，說(shuō)明燀杏仁中的苦杏仁苷酶在高溫條件下失活，達(dá)到了“殺酶保苷”的作用。另外燀杏仁中明顯缺少1、3、7號(hào)峰，可能是由于這3個(gè)峰為苦杏仁苷水解產(chǎn)物，生杏仁在提取過(guò)程中遇水酶解，而燀杏仁由于酶失活，無(wú)法酶解生成1、3、7號(hào)峰。

圖5 15批燀杏仁指紋圖譜Fig.5 Fingerprint chromatogram of 15 batches of blanched almonds

a苦杏仁苷對(duì)照品；b苦杏仁藥材(批號(hào)：Y18052801)供試品；c燀杏仁(批號(hào)：P18052801)供試品圖6 苦杏仁藥材與燀杏仁高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatogram

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法進(jìn)行苦杏仁藥材指紋圖譜分析，提供了一種苦杏仁藥材水提液指紋圖譜條件?？嘈尤受赵诳嘈尤仕幉闹型ǔＲ訢-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷兩種形式存在，由于D-苦杏仁苷、L-苦杏仁苷化學(xué)性質(zhì)接近，二者的色譜行為也較為一致，因此在HPLC中較難分離[10]。通過(guò)對(duì)比不同型號(hào)色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)Kinetex C18(2.6 μm,100 mm×4.6 mm)色譜柱對(duì)L-苦杏仁苷(圖6b 5號(hào)峰)和D-苦杏仁苷(圖6b 6號(hào)峰)有較好的分離效果。通過(guò)考察不同流速和柱溫，發(fā)現(xiàn)在流速0.6 mL·min-1、柱溫20 ℃條件下，圖譜中1、2號(hào)峰能夠達(dá)到基線(xiàn)分離。

15批不同產(chǎn)地的苦杏仁藥材色譜峰中，共有7個(gè)共有峰。方法學(xué)考察結(jié)果顯示其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性良好。中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)結(jié)果顯示具有較好的相似度。通過(guò)對(duì)比生杏仁與燀杏仁的HPLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)燀杏仁中5、6號(hào)峰苦杏仁苷含量明顯高于生杏仁，且缺少1、3、7號(hào)峰，推測(cè)是由于生杏仁中含有苦杏仁苷酶，導(dǎo)致苦杏仁苷在提取過(guò)程中遇水酶解未生成1、3、7號(hào)峰。本實(shí)驗(yàn)所建立的色譜條件能夠?yàn)榭嘈尤仕幉馁|(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立及含苦杏仁的復(fù)方制劑質(zhì)量控制提供參考。