氣相色譜法測定藥物中間體2-甲基咪唑中乙醛的殘留量

翁秀芳，董衛(wèi)莉，張慕軍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津藥物研究院原料藥研究中心，天津300193）

甲硝唑是硝基咪唑類抗生素，具有抗感染的作用，是抗厭氧菌的首選藥物[1]，臨床上多用于抗阿米巴原蟲、抗滴蟲，艱難梭菌感染的腹瀉的治療[2]。二甲硝咪唑?qū)陬^組織滴蟲、鞭毛蟲等原蟲，及壞死厭氧絲桿菌、腸弧菌等細(xì)菌，具有顯著抑制作用。2-甲基咪唑是用于生產(chǎn)甲硝唑和二甲硝唑等藥物的中間體[3-4]，可用作環(huán)氧樹脂等固化劑，纖維織品染料的輔助劑，制備泡沫塑料時(shí)的添加劑。

以乙醛、乙二醛、氨為原料經(jīng)Redziszewsk反應(yīng)，可一步生成2-甲基咪唑，該法反應(yīng)后，于減壓下濃縮，冷卻至室溫，析出結(jié)晶即為產(chǎn)品，經(jīng)分離后，母液經(jīng)進(jìn)一步分離處理也可得到含量約90%的產(chǎn)品。此法反應(yīng)條件比較溫和，原料易得，工藝簡單，操作方便，設(shè)備要求不高，反應(yīng)收率為80%以上，成本較低，這是目前國內(nèi)大多數(shù)廠家采用的方法。其反應(yīng)方程式如下[5]：

乙醛是一種無色、有強(qiáng)烈的刺激性氣味易流動液體，易溶于水、醇類等。乙醛是酒精中酵母發(fā)酵的中間代謝物，是一種致癌物質(zhì)[6-7]。研究表明，乙醛的毒性大約是酒精毒性的5.3倍[8]，其能與機(jī)體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)或膜物質(zhì)結(jié)合，形成乙醛-蛋白質(zhì)加合物而干擾多種酶的催化性質(zhì)，影響細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑和生物膜的完整性。乙醛與微管的結(jié)構(gòu)蛋白(微管蛋白)的高反應(yīng)性賴氨酸殘基結(jié)合，結(jié)果損害了微管的聚合和結(jié)構(gòu)，并抑制了蛋白質(zhì)、脂蛋白和糖蛋白的分泌[9]。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將乙醛列為2類致癌物質(zhì)清單中。因此，需要對乙醛的殘留量加以控制。由于乙醛為小分子化合物，易揮發(fā)，并且在紫外區(qū)的吸收較低，無法進(jìn)行高效液相色譜法檢測。文獻(xiàn)報(bào)道乙醛的測定方法主要有衍生化法（液相色譜[10-13]或紫外分光光度計(jì)測定[14]）、氣相色譜法（頂空進(jìn)樣[15-16]）等。衍生化法操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)步驟繁多，且衍生化試劑具有較大毒性，未采用該方法。采用頂空進(jìn)樣法測定乙醛時(shí)，筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)利用該方法測定乙醛，加樣回收率只有20%～27%。因?yàn)橐胰┓悬c(diǎn)較低，僅20.8℃，化學(xué)性質(zhì)活潑，在持續(xù)高溫條件下，2-甲基咪唑會提供堿性環(huán)境，堿與乙醛中的α-氫結(jié)合，形成一個(gè)碳負(fù)離子，作為親核試劑，立即進(jìn)攻另一個(gè)乙醛分子中的羰基碳原子，發(fā)生加成反應(yīng)，生成烷氧負(fù)離子，再結(jié)合一個(gè)質(zhì)子，形成β-羥基醛，β-羥基醛受熱易脫水生成α，β-不飽和醛。故不能采用該方法測定乙醛殘留量。

本研究的目的是建立一種采用氣相色譜檢測2-甲基咪唑中乙醛殘留量的方法。該操作簡單，分析速度快、毒性較小，可以消除樣品對乙醛測定的干擾。該方法根據(jù)ICH指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[17]，具有一定的準(zhǔn)確度、精密度和耐用性，從而測定乙醛的殘留量[18]。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 7890B氣相色譜儀（安捷倫，美國）和G4513A自動進(jìn)樣器（安捷倫，美國），火焰離子檢測器（安捷倫，美國），Metter XS205DV電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）。

1.2 試藥 乙腈（色譜純,德國默克），乙醛（無水級，Aladdin，批號 J1709020），2-甲基咪唑（平湖艾泊有限公司，20180120；嘉興艾森有限公司，20171011、20171220、20171220；湖北興銀河化工公司，M-2017101501）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用Aglilent DB-624色譜柱（75 m × 530 μm × 3 μm），液體進(jìn)樣，進(jìn)樣量為 2 μL；進(jìn)樣口溫度為250℃；檢測器溫度為280℃；分流比為 5：1；載氣為 N2；恒流，流速 6 mL·min-1；恒溫：起始溫度50℃，保持5.5 min；后運(yùn)行：溫度為240℃，保持 10.5 min，流量為 8 mL·min-1。

1.3.2 乙醛殘留量的計(jì)算

AS：供試品溶液中乙醛的峰面積；Cs：供試品溶液的溶度（mg·mL-1）

AR：對照品溶液中乙醛的峰面積；CR：對照品溶液的濃度（mg·mL-1）。

1.3.3 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：取2-甲基咪唑適量，精密稱定，用乙腈溶解并定量稀釋成每1 mL含有2-甲基咪唑20 mg，作為供試品溶液。

（2）對照品溶液的制備：取無水級乙醛適量，精密稱定，用乙腈溶解并稀釋成每1 mL含有乙醛400 μg，作為乙醛對照品儲備液。精密吸取0.75 mL乙醛對照品儲備液置于100 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋并制成每1mL含有乙醛3μg，作為對照品溶液。

1.3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取乙醛對照品儲備液2.5 mL，置于10 mL容量瓶中加入乙腈稀釋并定容至刻度；作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，并記錄色譜圖。

1.3.5 專屬性試驗(yàn) 制備適量濃度的乙二醛溶液、供試品溶液、乙醛對照溶液及純乙腈，分別進(jìn)樣各分析1次，記錄譜圖。

1.3.6 靈敏度試驗(yàn)

1.3.6.1 檢出限和定量限：將乙醛對照品儲備溶液逐級稀釋，要求檢出限（LOD,limit of detection）信噪比不小于3，定量限（LOQ,limit of quantity）的信噪比不小于10。

1.3.6.2 檢出限和定量限的重復(fù)性：制備乙醛的LOD溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析3次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6.3 定量限的準(zhǔn)確度：將6份加入定量限濃度乙醛的供試品溶液，按色譜條件依次進(jìn)樣分析1次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 線性關(guān)系考察 在定量限至一定的濃度范圍內(nèi)（包括限度濃度）制備6份濃度不同的乙醛溶液，依次進(jìn)樣分析3次，以峰面積為縱坐標(biāo)，乙醛溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.8 精密度試驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和中間精密度實(shí)驗(yàn)。

（1）重復(fù)性：將6份加入限度濃度乙醛的供試品溶液，按色譜條件依次進(jìn)樣分析1次，計(jì)算回收率。

（2）中間精密度：由不同的實(shí)驗(yàn)人員在不同的時(shí)間、不同的儀器，使用不同的試劑，以6份加入限度濃度乙醛的供試品溶液，按色譜條件依次進(jìn)樣分析1次，分別計(jì)算12個(gè)供試品溶液回收率。

1.3.9 準(zhǔn)確度 將加入80%的限度濃度乙醛、100%限度濃度乙醛、120%限度濃度乙醛的供試品溶液各3份，按色譜條件依次進(jìn)樣分析1次，計(jì)算回收率。

1.3.10 耐用性 將加入限度濃度乙醛的供試品溶

液分別以柱流量為5.5 mL·min-1和6.5 mL·min-1替代6 mL·min-1，其他條件保持不變。以柱溫48℃和52℃替代50℃，其他條件不變以及正常色譜條件下，依次進(jìn)樣分析兩次，分別計(jì)算不同變化條件下的回收率。

1.3.11 穩(wěn)定性 將對照品溶液、供試品溶液、加入限度溶液的供試品溶液，在25 h內(nèi)取n（n≥10）個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各溶液分別進(jìn)行分析1次。分別計(jì)算n個(gè)對照品溶液中乙醛峰面積和RSD，n個(gè)供試品溶液中乙醛峰面積和RSD。

1.3.12 樣品檢測 將限度濃度的乙醛溶液加入5批不同批號的2-甲基咪唑供試品溶液中，每個(gè)供試品溶液按色譜條件依次進(jìn)樣分析1次，計(jì)算乙醛殘留量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果 當(dāng)采用氣相色譜方法進(jìn)行檢測或者方法學(xué)前，通常是需要確認(rèn)色譜系統(tǒng)能夠滿足當(dāng)前的分析要求。這種測試的實(shí)質(zhì)是電路、儀器、樣品和分析操作構(gòu)成整個(gè)系統(tǒng)，需要做一個(gè)整體評價(jià)。制備新的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液進(jìn)行測試，結(jié)果見表1。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results for System Suitability

由表1可知，乙醛峰面積的RSD（n=6）為0.70%＜2.0%，保留時(shí)間 RSD（n=6）為 0＜1.0%，拖尾因子＜2.0，理論塔板數(shù)＞50 000，符合系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

2.2 專屬性結(jié)果 樣品中可能存在其他成分的情況下，所用分析方法能夠準(zhǔn)確地、選擇性地檢識被測組分的能力，又稱為選擇性或?qū)Ｒ恍浴Ｖ饕强疾祀s質(zhì)及其他成分對待檢成分測定結(jié)果的影響，通過空白試驗(yàn)來考察。結(jié)果見圖1～3。結(jié)果表明空白乙腈對檢測乙醛無干擾，乙二醛、2-甲基咪唑中及其雜質(zhì)在5.5 min內(nèi)均無檢出，該方法專屬性良好。

2.3 靈敏度結(jié)果 實(shí)驗(yàn)得乙醛的檢出限為0.55 μg·mL-1，定量限為 1.3 μg·mL-1，LOD 三針的保留時(shí)間RSD（n=3）=0.022% ＜1.0%；LOQ 六針的保留時(shí)間的RSD（n=6）=0.01% ＜ 1.0%，六針峰面積的 RSD（n=6）=1.22%＜6%，均符合要求，證明該方法具有較好的靈敏度。LOQ的6個(gè)加樣回收率在100.26～103.14均在藥典規(guī)定的回收率限度85%～110%的范圍內(nèi)，且RSD（n=6）=1.31%小于藥典規(guī)定的RSD可接受范圍4%。該方法具有一定的靈敏度。

圖1 空白乙腈GC色譜圖Fig 1 Chromatogram of acetonitrile

圖2 乙醛GC色譜圖Fig 2 Chromatogram of acetaldehyde

圖3 混合溶液GC色譜圖Fig 3 Chromatogram of mixed solution

2.4 線性關(guān)系考察結(jié)果 由下圖可知，乙醛在1.36～188.96 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=1.916 8X-0.413，截距的絕對值0.413小于100%響應(yīng)值的25%，線性方程的相關(guān)系數(shù)＞0.998，且6個(gè)響應(yīng)因子RSD（n=6）＜10.0%。表明其濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

圖4 線性范圍考察結(jié)果圖Fig 4 Results for Linearity

2.5 精密度結(jié)果 重復(fù)性試驗(yàn)的6個(gè)加樣回收率在97.63%～100.08%均在85.0%～110.0%的范圍內(nèi)，且RSD（n=6）=0.91%小于4.0%。均符合藥典要求。表明該方法重復(fù)性良好。12份供試液回收率的RSD(n=12）=1.26%＜4.0%，表明該實(shí)驗(yàn)方法的中間精密度良好。

2.6 準(zhǔn)確度結(jié)果 由表2可知，3個(gè)濃度的9個(gè)加樣回收率在99.74%～102.87%均在85.0%～110.0%的范圍內(nèi)，且9個(gè)加樣回收率的RSD（n=9）=1.19%小于4.0%，均符合藥典要求。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results for accuracy

2.7 耐用性結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流速在（6±0.5）mL·min-1變化，6個(gè)回收率均在 85.0%～110.0%的范圍內(nèi)，且6個(gè)回收率的RSD（n=6）=0.89%小于2.0%；起始柱溫在（50±2）℃變化，6個(gè)回收率均在85.0%～110.0%的范圍內(nèi)，且 RSD（n=6）=1.97%小于2.0%，證明該方法的耐用性較好。

2.8 穩(wěn)定性結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品供試液在25 h內(nèi)無乙醛產(chǎn)生；乙醛對照品溶液在25 h內(nèi)峰面積 RSD（n=13）=1.06%＜4.0%；26個(gè)加樣的乙醛回收率在85.0%～110.0%范圍內(nèi)，峰面積 RSD（n=26）=0.81%＜4.0%，表明樣品溶液、乙醛對照品溶液、加樣溶液在25 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.9 測樣結(jié)果 結(jié)果表明，5批樣品中乙醛的含量均低于最低檢出限，未能檢出，故5批樣品均合格。

3 討論

3.1 色譜柱的篩選 先后采用極性不同的色譜柱Agilent DB-1（30 m×0.53 mm×3 μm），Agilent DB-624（30 m×0.53 mm×3 μm），Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1μm），Agilent-FFAP （60m×530μm×3μm），根據(jù)目標(biāo)峰的保留時(shí)間、拖尾因子和理論塔板數(shù)及分離度，選擇Agilent DB-624毛細(xì)管柱，由于乙醛沸點(diǎn)很低，故采用 Aglilent DB-624（75 m×530 μm×3 μm）毛細(xì)管柱增加乙醛的保留。

3.2 柱溫和柱流量的篩選 根據(jù)乙醛性質(zhì)活潑，出峰時(shí)間較早，樣品2-甲基咪唑?qū)ζ錅y定無干擾，故采用柱溫恒溫，后運(yùn)行高純氮尾吹的方法，目的是將2-甲基咪唑和高沸點(diǎn)雜質(zhì)吹出色譜柱。根據(jù)目標(biāo)峰的保留時(shí)間、拖尾因子和理論塔板數(shù)及分離度，確定柱溫、柱流量。恒溫：起始溫度50℃，保持5.5 min；后運(yùn)行：溫度為240℃，保持10.5 min，流量為 8 mL·min-1。

本文的目的是開發(fā)出一種快速、簡易、環(huán)保的采用液體直接進(jìn)樣方式檢測乙醛殘留量的氣相色譜方法。從最經(jīng)濟(jì)最耐用的非極性毛細(xì)管柱到極性毛細(xì)管柱進(jìn)行篩選，從不同的起始柱溫、升溫速率及柱流量進(jìn)行了色譜條件的優(yōu)化來確定最佳檢測參數(shù)。乙醛溶劑殘留在藥典及ICH中沒有明確的限量要求，通過查閱以往藥品注冊數(shù)據(jù)、乙醛相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)及美國政府工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家會議推薦接觸限值，確定乙醛的限度為150 ppm。本方法根據(jù)ICH分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則從系統(tǒng)適應(yīng)性、專屬性、靈敏度、線性、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性、溶液穩(wěn)定性等方面對藥物中間體2-甲基咪唑中乙醛的殘留量進(jìn)行方法學(xué)研究，結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有良好的耐用性和穩(wěn)定性。