星點設計-效應面法優(yōu)化酶法提取黃連中鹽酸小檗堿工藝

楊紅艷 許建麗

摘要：目的? 研究黃連中鹽酸小檗堿的酶法輔助超聲提取工藝，并優(yōu)化酶解工藝參數。方法? 采用果膠酶酶解后超聲促提方法提取黃連中的鹽酸小檗堿，在單因素試驗的基礎上，選取酶用量、酶解溫度和酶解pH值為影響因素，通過星點設計-效應面法優(yōu)化酶解工藝參數，并利用多元線性回歸和二項式回歸建立預測模型。結果? 最佳酶解工藝為酶用量1.33%、酶解溫度45.8 ℃、酶解pH值2.68，在該優(yōu)化條件下，鹽酸小檗堿提取率為96.3%，與模型預測值（97.0%）相差0.7%。結論? 采用酶法輔助超聲提取可充分提取出黃連中的鹽酸小檗堿，且利用二項式回歸所建立的模型具有較好的預測性。

關鍵詞：黃連;鹽酸小檗堿;酶法提取;星點設計-效應面法

中圖分類號：R284.2??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0089-05

Abstract： Objective To study the enzymatic assisted ultrasonic extraction process of berberine hydrochloride from Coptidis Rhizoma; To optimize enzymatic hydrolysis parameters. Methods Berberine hydrochloride was extracted from Coptidis Rhizoma by pectinase enzymatic hydrolysis and ultrasonic extraction. Base on single factor experiments， three factors of enzyme dosage， enzymolysis temperature， and pH value were chosen to optimize the pectinase extraction conditions by central composite design and response surface method. The prediction model was established by multiple linear regression and binomial regression. Results The optimum enzymatic hydrolysis process was as follows： the enzyme dosage 1.33%， the enzymolysis temperature 45.8 ℃， and the pH value 2.68. Under these conditions， the extraction rate of berberine hydrochloride was 96.3%， which was different from the model prediction （97.0%） by 0.7%. Conclusion The method of enzymatic assisted ultrasonic extraction can be used to extract berberine hydrochloride from Coptidis Rhizoma. Meanwhile， the established binomial regression model has better predictability.

Keywords： Coptidis Rhizoma; berberine hydrochloride; enzymatic extraction; central composite design and response surface method

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖，其味苦、寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃連主要有效成分是以鹽酸小檗堿為代表的生物堿類化合物，屬于苯并異喹啉類季銨型生物堿，具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗心力衰竭、降血壓、抗腫瘤，以及對腸道疾病、糖尿病和急性肺損傷的治療作用等[1-3]，用途極為廣泛。因此，如何最大限度從黃連中提取鹽酸小檗堿，從而有效利用資源，具有重要意義。

目前，鹽酸小檗堿的常規(guī)提取主要采用酸水、乙醇為溶媒進行回流、冷浸等方法處理[4]，普遍存在提取耗時較長、步驟多、消耗溶劑量大、提取效率相對較低的缺點。近年來，為了提高提取效率，新的強化提取技術（如微波技術、酶工程技術、超聲波技術等）被廣泛應用于中藥有效成分的提取[5-6]。其中，酶工程技術可根據植物細胞壁的構成特點，利用酶降解細胞壁的組成成分，破壞細胞壁結構，使活性成分充分暴露溶出，從而提高中藥有效成分提取率[7]。而超聲波技術可利用超聲波產生的強烈振動、空化效應、攪拌作用等加速植物有效成分進入溶劑，提高提取率，縮短提取時間，簡化操作步驟[8-9]。因此，本研究選擇采用酶法輔助與超聲促提相配合的復合提取工藝，以期最大限度提取黃連中的鹽酸小檗堿，提高資源利用率。

在工藝優(yōu)選的試驗設計方法上，目前較多采用的試驗設計方法有正交設計、均勻設計及星點設計-效應面優(yōu)化法，前兩者在試驗處理時可以取得較佳點，基本可以滿足一般試驗的要求，但存在試驗精度不夠、選擇的試驗取值僅接近最佳取值而無法精確找到最佳點、條件優(yōu)選憑經驗、不能靈敏考察各因素間的交互作用等缺點;而采用星點設計-效應面法設計試驗優(yōu)化方法，具有試驗次數少、試驗精度高、預測值精準等優(yōu)點，常被用于提取工藝優(yōu)化中[10-13]。因此，本試驗采用星點設計-效應面法優(yōu)化提取黃連中鹽酸小檗堿的酶解工藝參數，并建立預測模型，確定黃連中鹽酸小檗堿的最佳提取方案。

1? 儀器與試藥

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-20A紫外檢測器（日本島津公司），AL 104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），T9雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），DL-480E智能超聲清洗器（上海之信儀器有限公司），GWA-UP1-F超純水器（北京普析通用儀器有限責任公司），SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），PHSJ-3F實驗室pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司），KHW-8-8電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司）。

黃連藥材（產地四川），經嶺南師范學院制藥工程系夏敬民教授鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖;鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201613，純度86.8%），中國食品藥品檢定研究院;果膠酶（批號P034901），華邁科生物技術有限責任公司;甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2? 方法與結果

2.1? 鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1? 色譜條件

色譜柱為Pgrandsil-STC-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流動相為乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（以磷酸調節(jié)pH值為2.5）=35∶65，流速為1.0 mL/min，檢測波長為266 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為20 ?L。色譜圖見圖1。

2.1.2? 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.7 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（0.371 mg/mL）。

2.1.3? 供試品溶液的制備

取黃連藥材粉末（過24目篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率99 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4? 標準曲線的繪制

精密量取對照品貯備溶液（0.371 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為7.42、14.84、22.26、29.68、37.10、44.52、51.94 ?g/mL的系列溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，各精密吸取20 ?L注入液相色譜儀，記錄峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=1 044 418.82X+50 893.75（R2=0.999 6），結果表明鹽酸小檗堿在7.42～51.95 ?g/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5? 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 ?L，按“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣5次，測定其峰面積，結果峰面積RSD=1.43%，表明儀器精密度良好。

2.1.6? 穩(wěn)定性試驗

取新制備的供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、12 h，按“2.1.1”項下色譜條件，進樣20 ?L，測定其峰面積，結果峰面積RSD=1.51%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.1.7? 重復性試驗

取同一批黃連藥材粉末5份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 ?L，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件測定，分別計算鹽酸小檗堿含量，計算得RSD=1.62%，結果表明該方法重復性良好。

2.1.8? 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量（54.8 mg/g）的黃連藥材粉末約0.1 g，共9份，每3份分別精密加入相當于鹽酸小檗堿含量80%、100%、120%的對照品，按“2.1.3”項下方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果平均回收率為101.49%，RSD=2.70%，表明該法準確度高。

2.2? 鹽酸小檗堿提取工藝

稱取黃連藥材粉末2.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入適量蒸餾水（調節(jié)pH=4.0），加入適量果膠酶，置于35 ℃水浴中恒溫酶解2 h，過濾，收集濾液，將酶解后的黃連藥渣加蒸餾水超聲（功率99 W，頻率40 kHz）提取2次，每次25 min，合并濾液，定容至100 mL，從中精密吸取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。精密吸取樣品溶液20 ?L，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算鹽酸小檗堿含量及提取率。鹽酸小檗堿提取率（%）=（C×50×100）÷（2×1000×M）×100%。式中，C為樣品溶液中鹽酸小檗堿含量（?g/mL），M為黃連藥材中鹽酸小檗堿含量（54.8 mg/g）。

2.3? 單因素試驗

2.3.1? 酶用量考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，加8倍量蒸餾水（調節(jié)pH=4.0），調節(jié)果膠酶用量（質量分數）分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%，考察酶用量對鹽酸小檗堿提取率的影響，結果見圖2。

可以看出，隨著酶用量的增加，提取率逐漸增大，酶用量為1.5%時提取率達到最大，此后再增加酶用量，提取率反而下降，這可能是酶達到飽和后，酶量增加反而抑制了酶促反應。故最佳酶用量為1.5%。

2.3.2? 酶解時間考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，加入8倍量蒸餾水（調節(jié)pH=4.0），固定酶用量為1.5%，調節(jié)酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察不同酶解時間對鹽酸小檗堿提取率的影響，結果見圖3。可見，鹽酸小檗堿提取率隨酶解時間延長而升高，在2.5 h時達到最大值，隨后延長酶解時間提取率反而下降，故確定最佳酶解時間為2.5 h。

2.3.3? 酶解pH值考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共5份，分別置于具塞錐形瓶中，加入8倍量蒸餾水，調節(jié)pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，考察不同的酶解pH值對鹽酸小檗堿提取率的影響，結果見圖4?？梢?，鹽酸小檗堿提取率隨pH值增大而升高，在pH=3.0時達到最大值，隨后再增大pH值，提取率逐漸下降，說明在較低pH值條件下更有利于果膠酶活性的發(fā)揮，故確定最佳酶解pH值為3.0。

2.3.4? 酶解溫度考察

稱取黃連藥材粉末2.00 g，共5份，分別置于具塞錐形瓶中，加入8倍量蒸餾水（調節(jié)pH=3.0），固定酶用量為1.5%、酶解時間為2.5 h，調節(jié)酶解溫度分別為30、35、40、45、50、55 ℃，考察不同的酶解溫度對鹽酸小檗堿提取率的影響，結果見圖5。可見，鹽酸小檗堿提取率在30～40 ℃之間隨酶解溫度升高而增大，高于40 ℃后提取率下降，可能由于溫度過高導致酶活性下降。故最佳酶解溫度為40 ℃。

2.4? 星點設計-效應面法優(yōu)選酶解工藝

2.4.1? 試驗設計

在單因素考察基礎上，用星點設計-效應面法對酶解工藝的主要影響因素進行優(yōu)化，選擇酶用量、酶解溫度和pH值作為考察對象，采用三因素五水平表進行試驗，各因素水平編碼值見表1，試驗設計及結果見表2。

2.4.2? 模型擬合與方差分析

以鹽酸小檗堿提取率為因變量，酶用量（A）、酶解溫度（B）和酶解pH值（C）為自變量，采用Design-Expert8.0.6軟件對數據分別進行多元線性、二項式擬合。多元線性回歸方程：Y=36.164+3.489A+0.890B+4.726C（R2=0.556 2，P=0.003 9）;二項式回歸方程：Y=-334.267+23.755A+13.943B+69.381C-1.331AB+0.887AC-1.156BC+10.102A2-0.095B2-3.293C2（R2=0.916 0，P=0.000 3）。結果表明，多元線性回歸及二項式擬合模型均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但多元線性回歸模型的決定系數較低，且失擬項較顯著（P=0.024 2），說明該模型擬合不佳，預測性較差，因此多元線性模型不合適，選取二項式擬合模型進行方差分析。結果顯示，擬合模型P<0.001，失擬項P=0.238 3，決定系數大于0.9，表明該模型具有很好的擬合度，可用于分析和預測效應值。由擬合方程回歸系數顯著性檢驗的F值和P值可知，三因素對效應值的影響為酶解溫度（B）>酶解pH值（C）>酶用量（A）。一次項B、C，交互項BC及二次項B2對鹽酸小檗堿提取率有顯著影響（P<0.01），見表3。

2.4.3? 效應面分析及工藝優(yōu)選

根據二項式擬合模型繪制三維效應面與等高線圖，其中另一個自變量取中間值，見圖6。由效應面曲線可直觀分析各因素交互作用的影響情況，曲面越陡峭、彎曲度越大表明效應值對條件的改變越敏感，該因素的交互作用對鹽酸小檗堿提取率的影響就越大?？梢钥闯?，酶解溫度和酶解pH值對鹽酸小檗堿提取率的影響最大，提取率隨酶解溫度升高逐漸增大，隨酶解pH值升高呈先增大后減小的趨勢;酶用量在取值范圍內對提取率的影響不大。通過對回歸方程分析及優(yōu)化求解，得最優(yōu)酶解工藝參數為酶用量1.33%、酶解溫度45.8 ℃、酶解pH值2.68，在此條件下鹽酸小檗堿提取率預測值為97.0%。

圖6? 各因素對鹽酸小檗堿提取率影響的效應面和等高線圖

2.4.4? 驗證試驗

根據星點設計-效應面法優(yōu)選出的最佳工藝條件進行酶法提取驗證試驗，平行試驗3次，結果鹽酸小檗堿提取率分別為96.4%、96.1%、96.4%，平均提取率為96.3%，實測值與預測值誤差為0.7%，說明本研究建立的模型具有較好的預測性，優(yōu)化得到的酶法提取黃連中鹽酸小檗堿的工藝條件準確可靠。

3? 討論

本試驗研究了酶法提取黃連中鹽酸小檗堿的工藝參數。前期研究對超聲促提工藝條件進行了篩選，確定工藝條件為以8倍量蒸餾水作為溶媒、超聲提取2次、提取時間為25 min，并比較酶法與非酶法對鹽酸小檗堿提取率的影響，結果發(fā)現酶法能顯著提高鹽酸小檗堿提取率，因此最終確定采用酶法輔助超聲促提方法，并通過星點設計-效應面法優(yōu)化酶法提取的酶解工藝，得到優(yōu)化后的酶解工藝參數為：酶用量1.33%、酶解溫度45.8 ℃、pH值2.68，在此優(yōu)化工藝條件下，黃連中鹽酸小檗堿提取率可達96.3%，表明采用酶法輔助超聲促提方法可基本將黃連中的鹽酸小檗堿提取完全，可為含有鹽酸小檗堿類成分的藥材資源有效利用提供參考方法及試驗依據。

以酸水或乙醇為溶媒從黃連中提取鹽酸小檗堿，常采用煎煮、回流、冷浸等方法，除存在周期長、工序多、提取率不高等缺點外，酸水易造成環(huán)境污染，容易腐蝕設備，而以醇為溶媒溶劑回收操作繁瑣，總體耗時長。本研究選擇以水為溶媒，將酶法與超聲技術聯合應用于黃連中鹽酸小檗堿的提取，與傳統(tǒng)提取方法相比，有效提高了鹽酸小檗堿的提取率，節(jié)約了提取時間。本研究可為黃連中鹽酸小檗堿的提取提供一種條件溫和、環(huán)保、經濟、操作簡便的方法。

參考文獻：

[1] 胡誠毅，莫志賢.黃連素的藥理作用及機制研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（20）：213-219.

[2] 王麗萍，宋金春.小檗堿的藥理學研究進展[J].中國藥房，2013，24（43）：4111-4114.

[3] 張志輝，鄧安珺，于金倩，等.黃連堿藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38（17）：2750-2754.

[4] 胡寶平.小檗堿提取工藝研究進展[J].西南醫(yī)科大學學報，2011， 34（2）：214-216.

[5] 葉陳麗，賀帥，曹偉靈，等.中藥提取分離新技術的研究進展[J].中草藥，2015，46（3）：457-464.

[6] 高鐿萌，徐愿堅，杜洪飛，等.中藥提取新技術的研究進展[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現代化，2014，16（4）：890-894.

[7] 王源.酶工程技術在中藥提取中的應用[J].山東中醫(yī)雜志，2015， 34（8）：614-617.

[8] LIU L， SHEN B J， XIE D H， et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from Cimicifugae rhizoma with response surface methodology[J]. Pharmacognosy Magazine，2015，11（44）：682-689.

[9] 張衛(wèi)紅，吳曉霞，馬空軍.超聲波技術強化提取天然產物的研究進展[J].現代化工，2013，33（7）：26-29.

[10] 邱穎，朱玲，孫曉英.星點設計-效應面優(yōu)化法與正交設計和均勻設計的比較及其在藥劑研究中的應用[J].海峽藥學，2011，23（2）：18-20.

[11] 劉艷杰，項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用[J].中國現代應用藥學，2007，24（6）：455-457.

[12] 張玲，和煥香，劉武，等.星點設計-效應面法優(yōu)化纖維素酶法輔助提取鬼針草葉中總黃酮研究[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（10）：893-897.

[13] 梁丹，冷靜，龔月嬪，等.星點設計-效應面法優(yōu)選廣式涼茶解酒晶提取工藝[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（5）：2273-2276.