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    AFP陰性肝癌患者血清miR-451、miR-21與miR-200c的差異表達及價值分析

    2019-09-02 02:17:18常琳毛玉蘭黃茂華
    肝臟 2019年8期
    關(guān)鍵詞:良性淋巴結(jié)肝臟

    常琳 毛玉蘭 黃茂華

    AFP陰性肝癌(AFP-negative hepatocellular carcinoma,AFP-NHCC)是一類較為重要的肝癌類型,因其腫塊較小,影像學(xué)檢查易漏診[1]。目前對于AFP-NHCC的診斷仍然缺乏理想的標記物。微小RNA(MicroRNA,miR)是一種非編碼小RNA,其可通過靶向作用3’非翻譯區(qū)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄后翻譯[2-3]。近年已發(fā)現(xiàn)多種miR在HCC患者組織及體液中有差異表達,并有望作為HCC診斷的分子標志物[4-5]。本實驗通過比較AFP-NHCC、肝臟良性疾病及健康人群血清miR-451、miR-21與miR-200c水平,旨在尋找更有效的AFP-NHCC生物標志物。

    資料與方法

    一、研究對象

    選取2015年7月至2018年5月在我院經(jīng)病理學(xué)確診AFP-NHCC患者120例,其中Ⅰ-Ⅱ期患者79例,Ⅲ-Ⅳ期患者41例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例,未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移87例。同期收取120例肝臟良性疾病(乙型肝炎78例、肝硬化42例)和120例于我院健康體檢者。本項目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。

    二、 血清miR-451、miR-21與miR-200c表達水平的檢測

    使用促凝采血管收集AFP-NHCC患者和肝臟良性疾病患者接受治療前和健康對照者入院體檢時外周血5 mL,分離血清。

    按血清RNA提取試劑盒說明書步驟進行總血清RNA提取,使用莖環(huán)法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。引物序列見表1。采用2-ΔCt法計算相對表達量。miR-451、miR-21、miR-200c和U6基因熔解曲線峰型單一。

    表1 擴增miR-451、miR-21、miR-200c和U6的引物序列

    三、 統(tǒng)計學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料采用均值±標準差表示,兩組間和多組間比較分別采用兩獨立樣本t檢驗和方差分析。率的比較采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。受試者工作特征曲線(ROC)比較各指標對AFP-NHCC的鑒別能力。二元Logistic回歸計算各指標預(yù)測AFP-NHCC的比值比(OR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、基本資料及血清miR-451、miR-21、miR-200c水平比較

    如表2所示,三組間各基本資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AFP-NHCC患者miR-21水平(10.3±2.3)顯著高于肝臟良性疾病(4.5±0.9)和健康體檢者(4.0±0.5),P<0.05;AFP-NHCC患者miR-451(43.4±5.1)和miR-200c(12.8±0.6)水平顯著低于肝臟良性疾病(miR-451:103.3±10.4;miR-200c:25.8±1.3)和健康體檢者(miR-451:99.8±10.7;miR-200c:24.1±1.2),P<0.05;而肝臟良性疾病和健康體檢者間各指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    二、AFP-NHCC各指標與血清miR-451、miR-21、miR-200c的相關(guān)性

    血清miR-451、miR-21、miR-200c水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(miR-451:r=-0.521,P=0.006;miR-21:r= 0.505,P=0.020;miR-200c:r=-0.486,P=0.023)及TNM分級(miR-451:r=-0.513,P=0.016;miR-21:r= 0.591,P=0.003;miR-200c:r=-0.539,P=0.007)呈線性關(guān)聯(lián),見表3。

    三、 血清miR-451、miR-21、miR-200c對AFP-NHCC的鑒別價值

    在聯(lián)合血清miR-451、miR-21、miR-200c時區(qū)分AFP-NHCC與肝臟良性疾病患者和健康對照的靈敏度顯著提高達到89.3%,見表4和圖2。

    四、 血清miR-451、miR-21、miR-200c對AFP-NHCC的風(fēng)險評估

    二元logistic回歸指出,血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平是AFP-NHCC發(fā)病的危險因素(P<0.05),見表5。

    討 論

    miR-451、miR-21和miR-200c是近年研究發(fā)現(xiàn)的在HCC中起重要調(diào)控作用的三個非編碼RNA。Liu等[6]應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-451模擬物于Hep G2細胞以上調(diào)Hep G2細胞中miR-451的表達,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-451后可顯著抑制Hep G2細胞的增殖、侵襲與遷移能力。Guo等[7]的研究發(fā)現(xiàn),瞬時轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的Huh7細胞系,其增殖與遷移能力均顯著提高。Oishi等[8]則發(fā)現(xiàn)miR-200c在HCC患者癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織,當患者手術(shù)切除癌組織后外周血漿miR-200c水平較術(shù)前顯著升高。機理研究顯示miR-200c可通過抑制抑癌基因MAD2L1表達以促進HCC的進展[9]。前期研究提示,miR-451和miR-200c在HCC中扮演抑癌基因,而miR-21則發(fā)揮促癌基因功能。

    表2 基本資料比較

    表3 AFP-NHCC各指標與血清miR-451、miR-21、miR-200c的相關(guān)性分析

    表4 血清miR-451、miR-21、miR-200c對AFP-NHCC的ROC分析結(jié)果

    A圖為miR-451、miR-21與miR-200c鑒別曲線;B圖為聯(lián)合檢測曲線

    圖1 血清miR-451、miR-21、miR-200c對AFP-NHCC鑒別價值

    注:*為校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素后

    本研究我們通過臨床樣本血清中的檢測發(fā)現(xiàn),AFP-NHCC患者血清miR-21水平顯著高于肝臟良性疾病和健康對照,而miR-451和miR-200c水平顯著低于肝臟良性疾病和健康對照,與前期在HCC中的研究結(jié)果相符[6-9]。進一步分析發(fā)現(xiàn),低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平與AFP-NHCC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級相關(guān),且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ-Ⅳ期患者中miR-451和miR-200c降低最顯著,而miR-21升高也最顯著,表明血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c與AFP-NHCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

    ROC分析提示,血清miR-451、miR-21和miR-200c在區(qū)分AFP-NHCC與肝臟良性疾病患者和健康對照的靈敏度/特異度分別為77.3%/81.9%、80.7%/84.7%和69.2%/67.3%;而聯(lián)合三者后在區(qū)分AFP-NHCC與肝臟良性疾病患者和健康對照的靈敏度顯著提高,達到89.3%。二元Logistic回歸在校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素影響后,血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平仍是AFP-NHCC發(fā)病的獨立危險因素。上述研究我們發(fā)現(xiàn),血清miR-451、miR-21和miR-200c在AFP-NHCC鑒別診斷及風(fēng)險評估中均有一定價值。然而,本次研究有以下不足:(1)miR-451、miR-21和miR-200c聯(lián)合診斷模型的確切價值有待大樣本量的前瞻性研究進行驗證;(2)miR-451、miR-21和miR-200c三者雖與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期相關(guān),但由于我們未能獲取患者隨訪數(shù)據(jù),因為對于三者在AFP-NHCC的預(yù)后價值有待進一步探討。

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