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      活性維生素D3聯(lián)合IFN-α對肝纖維化小鼠肝纖維化程度、IL-6、TNF-α、TGF-β及Smad3表達(dá)的影響

      2019-09-02 02:17:20王樂錢毅駿
      肝臟 2019年8期
      關(guān)鍵詞:單藥小葉纖維化

      王樂 錢毅駿

      在肝臟受到肝炎病毒感染或受損時,其中肝臟庫普弗細(xì)胞可釋放大量促炎性介質(zhì),如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等,使得肝星狀細(xì)胞激活,使之處于活化狀態(tài),最終造成膠原的形成[1]。本研究通過構(gòu)建四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型,探討活性維生素D3聯(lián)合α-干擾素(interferon-α,IFN-α)對小鼠肝纖維化程度及細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

      資料與方法

      一、一般材料

      實驗動物:雌性BALB/c小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量15~25 g。

      主要試劑與儀器:z480型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)儀購自羅氏診斷公司,四氯化碳購自江蘇南大光電材料股份有限公司,TRIzol試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司,重組人IFN-α2b購自武漢艾美捷科技有限公司,活性維生素D3江蘇佰耀生物科技有限公司。

      二、方法

      模型的構(gòu)建及分組:經(jīng)腹腔注射10%四氯化碳5 μL/g,每周3次,共注射2周,成功構(gòu)建肝纖維化小鼠模型后,將小鼠隨機分為陰性對照組(皮下注射0.9%生理鹽水100 μL,隔日1次)、單藥1組(口服灌胃活性維生素D3 50 μg/kg,隔日1次)、單藥2組(皮下注射IFN-α 800 U,隔日1次)、聯(lián)合組(給予活性維生素D3+IFN-α,用法與用量與單藥組相同),每組各5只,另選取5只小鼠為正常對照組(皮下注射0.9%生理鹽水100 μL,隔日1次)。

      肝纖維化的檢查:采集各組小鼠肝臟組織,行組織病理學(xué)檢查,對組織進(jìn)行切片后行蘇木精-伊紅染色,并根據(jù)其嚴(yán)重程度進(jìn)行分級[5],分為0級:無纖維化,肝臟組織正常;Ⅰ級:存在纖維化,竇周與小葉內(nèi)纖維化,匯管區(qū)纖維化增大;Ⅱ級:輕度纖維化,匯管區(qū)周圍纖維化,形成纖維間隔,小葉結(jié)構(gòu)無異常;Ⅲ級:中度纖維化,形成纖維間隔,且小葉結(jié)構(gòu)異常,但未出現(xiàn)肝硬化;Ⅳ級:重度纖維化,形成纖維間隔且增厚,并出現(xiàn)諸多假小葉。

      細(xì)胞因子含量的檢測:通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對各組小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β、TNF-α及IL-6的含量進(jìn)行檢測,嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書指示完成檢測操作。

      Smad3 mRNA表達(dá)的檢測:對各組小鼠肝組織中的總RNA夾心提取,mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,之后行RT-qPCR。反應(yīng)條件:95℃進(jìn)行預(yù)變性30 s,以相同溫度進(jìn)行變性10 s,之后以60℃退火30 s,以相同溫度進(jìn)行延伸60 s,進(jìn)行30個循環(huán),并以β-actin作為內(nèi)參。

      三、統(tǒng)計學(xué)方法

      結(jié) 果

      一、組織病理學(xué)檢查結(jié)果

      陰性對照組肝索排列不齊,肝小葉結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞水腫,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,匯管區(qū)出現(xiàn)諸多炎性細(xì)胞浸潤且伴有纖維組織增生,脂肪變性明顯,形成纖維間隔,伴有小葉結(jié)構(gòu)異常;單藥1、2組及聯(lián)合組小葉結(jié)構(gòu)未見破壞,但出現(xiàn)少量纖維間隔,匯管區(qū)纖維組織增生且出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤;正常對照組無炎性細(xì)胞浸潤,肝索整齊排列,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝小葉間未出現(xiàn)纖維組織增生,匯管區(qū)未見纖維化。見圖1。

      二、肝纖維化分級結(jié)果

      單藥1、2組及聯(lián)合組肝纖維化程度接近,無顯著性差異;但陰性對照組肝纖維化程度較其它組明顯加重。見表1。

      表1 各組小鼠肝纖維化分級結(jié)果(例)

      三、細(xì)胞因子的檢測結(jié)果

      結(jié)果顯示,單藥1、2組及聯(lián)合組TGF-β和TNF-α含量較正常對照組明顯升高,但較陰性對照組明顯下降(P<0.05);單藥1、2組IL-6含量較其它組明顯下降(P<0.05),聯(lián)合組IL-6含量較陰性對照組明顯下降,但較單藥1、2組明顯升高(P<0.05)。見表2。

      四、Smad3 mRNA的檢測結(jié)果

      結(jié)果顯示,正常對照組、陰性對照組、單藥1組、單藥2組、聯(lián)合組小鼠Smad3 mRNA表達(dá)水平分別為(1.02±0.03)、(3.08±0.82)、(0.67±0.22)、(0.66±0.24)、(0.70±0.25)。結(jié)果顯示,單藥1、2組及聯(lián)合組Smad3 mRNA表達(dá)水平較正常對照組和陰性對照組明顯下降(P<0.05)。

      討 論

      活性維生素D3即為維生素的的活性形式,其對骨鈣鹽沉積及鈣磷代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。既往研究報道[3-4],活性維生素D3對適應(yīng)性及先天性免疫功能及其細(xì)胞的生成和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用,且可阻滯心肌、肺、肝臟及腎臟纖維化的進(jìn)展。已有研究表明[5-6],IFN-α可通過調(diào)控肝臟細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞水平直接起到抗纖維化的作用?;钚跃S生素D3與IFN-α均可起到良好的抗纖維化作用,二者的相關(guān)機制存在一定的交叉重疊。本研究發(fā)現(xiàn),單藥1、2組及聯(lián)合組肝纖維化程度接近,無顯著性差異;但陰性對照組肝纖維化程度較其他組明顯加重。并且,單藥1、2組及聯(lián)合組小葉結(jié)構(gòu)未見破壞,但出現(xiàn)少量纖維間隔,匯管區(qū)纖維組織增生且出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤;而陰性對照組肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)果表明,單獨或聯(lián)合應(yīng)用活性維生素D3與IFN-α均具有抗纖維化作用但聯(lián)合應(yīng)用不存在疊加效應(yīng)。

      注:A:正常對照組,B:陰性對照組,C:單藥1組,D組:單藥2組,E:聯(lián)合組

      組別nTGF-βTNF-αIL-6正常對照組520.09±5.134.87±0.3537.07±4.12陰性對照組5454.95±144.0515.09±3.2244.98±5.12a單藥1組5378.97±86.23ab8.35±1.43ab18.97±3.22ab單藥2組5372.14±97.58ab8.29±1.57ab18.88±2.95ab聯(lián)合組5382.85±74.86ab8.14±1.63ab36.98±3.85bcdF96.4610.0316.97P<0.01<0.01<0.01

      注:與正常對照組比較,aP<0.05;與陰性對照組比較,bP<0.05;與單藥1組,cP<0.05;與單藥2組比較,dP<0.05

      TNF-α具有誘導(dǎo)肝內(nèi)纖維母細(xì)胞和Ito細(xì)胞增殖的作用,且可使之轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞。IL-6可通過刺激炎性反應(yīng)使得纖維化形成,同時可通過加強細(xì)胞外基質(zhì)的合成而對肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起到促進(jìn)作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn),單藥1、2組及聯(lián)合組TGF-β和TNF-α含量較正常對照組明顯升高,但較陰性對照組明顯下降;單藥1、2組IL-6含量較其它組明顯下降,聯(lián)合組IL-6含量較陰性對照組明顯下降,但較單藥1、2組明顯升高。結(jié)果表明,單獨或聯(lián)合應(yīng)用活性維生素D3、IFN-α均可時肝纖維化小鼠肝內(nèi)促炎性因子TNF-α與IL-6含量下降,但聯(lián)合應(yīng)用未能起到有效阻滯促炎性因子生成的作用,并且聯(lián)合治療后IL-6的療效差于單獨用藥組。究其原因,可能因活性維生素D3與IFN-α聯(lián)合治療可能存在拮抗效應(yīng)。

      TGF-β、肝星狀細(xì)胞活化、基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子均在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用,且上述因素具有相互調(diào)節(jié)作用,可形成復(fù)雜的系統(tǒng)[8]。TGF-β是促進(jìn)組織纖維化形成的主要因子之一,其可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成,并且對細(xì)胞外基質(zhì)的降解具有抑制作用[9]?;罨母涡菭罴?xì)胞具有表達(dá)促纖維化關(guān)鍵因子的受體的作用,如TGF-β1及血小板驅(qū)動生長因子等,可進(jìn)一步促進(jìn)相關(guān)信號通路的激活[10]。在發(fā)生肝纖維化時,Smad3可作為一種細(xì)胞內(nèi)主要信號傳導(dǎo)介質(zhì),作為調(diào)控肝纖維化進(jìn)展的主要因素,其可將信號由胞質(zhì)傳至細(xì)胞核內(nèi),對目的基因的表達(dá)具有調(diào)控作用,并且可誘導(dǎo)膠原合成,活化肝星狀細(xì)胞[11]。據(jù)報道[12],活性維生素D3與IFN-α可通過TGF-β/Smad3通路起到阻滯肝纖維化發(fā)生及發(fā)展的作用。本研究發(fā)現(xiàn),單藥1、2組及聯(lián)合組Smad3 mRNA表達(dá)水平較正常對照組和陰性對照組明顯下降。結(jié)果表明,無論是單獨應(yīng)用活性維生素D3、IFN-α,亦或是聯(lián)合治療均可促使肝纖維化小鼠肝內(nèi)TGF-β含量及Smad mRNA表達(dá)水平降低。結(jié)果提示,活性維生素D3與IFN-α單獨或聯(lián)合治療均具有良好的療效,但聯(lián)合治療并無疊加效應(yīng)。

      綜上所述,活性維生素D3、IFN-α單獨或聯(lián)合治療肝纖維化小鼠具有相似的臨床療效,聯(lián)合治療并無疊加效應(yīng)。由于TGF-β/Smad3通路活化可有效促進(jìn)肝纖維化的形成,因此通過阻斷此通路可能是治療肝纖維化的潛在靶點。

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