永生化肝臟前體樣細胞可用于生物人工肝治療的研究

李偉建 王振宇 袁天杰 景宏舒 代孟君 彭媛 鄢和新 翟博

生物人工肝(bioartificial liver，BAL)可以暫時替代肝臟發(fā)揮相應(yīng)的功能。種子細胞是BAL的核心，目前用于BAL的細胞有人原代細胞、C3A、豬肝細胞、誘導分化肝細胞等。但是由于種種原因，BAL臨床推進緩慢，因此急需尋找到用于生物人工肝的新種子細胞。2018年，在前期的小鼠肝前體樣細胞(HepLPC)可逆轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上通過小分子組合將人原代細胞轉(zhuǎn)化為前體樣細胞，實現(xiàn)人原代肝細胞體外快速增殖[1]。本實驗對前體樣細胞進行永生化并進行功能驗證，尋找新的用于生物人工肝治療的細胞，為臨床生物人工肝治療提供參考。

資料與方法

一、材料與試劑

肝臟組織標本來自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤介入科患者血管瘤旁組織。DMEM/F12購自美國Invitrogen公司；N-2 無血清添加劑、100X和B-27 無血清添加劑、50X以及雙抗購自上海源培生物科技股份有限公司；Trizol和Sybgreen購自上海碧云天生物科技公司；FBS購自于BI公司；相關(guān)引物合成自上海華津生物。HGF、EGF、Y27632、CHIR99021、A83-01購自于美國TargetMol公司；0.25% T/E購自上海源培生物科技股份有限公司；Large T抗原慢病毒購自吉凱基因。

二、實驗方法

(一)人原代細胞的分離與純化與培養(yǎng) 血管瘤旁切除(1～5 g)正常肝組織，通過改良的兩步膠原酶灌注法分離原代人肝細胞，熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)純化肝細胞以排除CD24 +或EpCAM +陽性祖細胞獲得HepLPC[1-2]。將細胞以0.5～2×104cells/cm2接種在有Matrigel(約0.87 μL/cm2)包被的培養(yǎng)皿上，采用增殖與擴增培養(yǎng)基(TEM)培養(yǎng)，接種后6～12 d，用0.25%T/E消化重懸后以1∶3～6的比例傳代，每隔24 h更換1次培養(yǎng)基。將1 000個細胞接種在6孔Matrigel包被的平板上，用0.25%T/E消化后在指定的天數(shù)進行細胞計數(shù)。

(二)永生化的建立 2～3×105cells/孔的濃度接種于用Matrigel鋪板后的6孔板中， 24 h后待細胞匯合率到達80%時開始永生化的建立。MOI=20加入慢病毒Large T antigen(約50 μL/孔)轉(zhuǎn)染細胞，加入8 μg Polybrene增強感染效果。感染8 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染病毒72 h后，以1∶1 000加入腺嘌呤素(puro)至TEM培養(yǎng)進一步篩選成功轉(zhuǎn)染細胞。24～48 h后換TEM培養(yǎng)基，并重新傳代至已用Matrigel鋪板的6孔板。細胞以1∶3的密度穩(wěn)當細胞傳代超過20代的一般認為永生化建系成功。永生化建立過程中注意對細胞凍存與復蘇進行保種，同時進行細胞計數(shù)。

(三)細胞分化 將3×105iHepLPC接種到Matrigel包被好的6孔板中，增殖1～2 d，直至達到90%以上的細胞覆率。然后更換為M7分化培養(yǎng)基分化7 d。

(四)實時PCR 使用Trizol試劑從培養(yǎng)的細胞中提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA使用7 300實時PCR系統(tǒng)，Sybgreen并以GAPDH為內(nèi)參進行內(nèi)部控制計算相關(guān)基因的表達量。PCR系統(tǒng)設(shè)置參數(shù)為20 μL體系，95℃ 5 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 35 s，共40個循環(huán)；循環(huán)后使用機器默認程序進行熔解曲線采樣。后按照△△CT方式進行數(shù)據(jù)分析，每個樣本重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

(五)尿素生成 iHepLPC培養(yǎng)基中加入3 mmol NH4Cl，24 h后吸取細胞上清，3 000 rpm離心5 min去除沉淀，檢測細胞上清中的NH4+的含量，從而判定iHepLPC細胞的氨清除速率。尿素含量檢測方法按試劑盒說明書進行。

(六)白蛋白ELISA 細胞更換培養(yǎng)基后24 h收集上清，3 000 r/min離心5 min去除沉淀，培養(yǎng)液中的白蛋白和AAT分別用人白蛋白ELISA試劑盒和人AAT ELISA試劑盒進行檢測，操作按照試劑盒內(nèi)說明書進行。

(七)急性肝衰竭小豬血漿以及對細胞的功能反應(yīng) 采用0.5 g/kg氨基半乳糖氨(D-gal)誘導小豬急性肝衰竭，24 h后小豬出現(xiàn)ALF的相關(guān)癥狀與體征，血氨、出凝血以及肝腎功能達到急性肝衰竭指標。取小豬血液，4 500 r/min離心15 min，收集上清作為急性肝衰竭血漿-80℃保存?zhèn)溆?。將細胞分化培養(yǎng)基更換成急性肝衰竭血漿，反應(yīng)6 h，計算細胞活率，同時驗證細胞的功能基因以及合成與解毒功能。

三、統(tǒng)計學處理

使用軟件GraphPad Prism 7。數(shù)值均以均值±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)比較使用Student′sttest。使用One-way analysis of variance (ANOVA)進行3組及以上的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、HepLPC細胞永生化建立

選取Passage 0～20的細胞，每間隔10代觀察細胞形態(tài)和細胞計數(shù)，增殖過程中細胞之間的形態(tài)保持一致，無任何改變，每間隔10代還具有相似的增殖速度，說明永生化細胞建立成功，見表2。在增殖過程中對細胞的反應(yīng)合成，尿素生成，藥物代謝Alb，AAT，CPS1，CYP3A4等主要肝功能基因做檢測，每個代次之間表達量保持穩(wěn)定。

尿素生成是反應(yīng)器肝細胞解毒功能的主要指標，對每10代次的細胞進行尿素生成的檢驗。發(fā)現(xiàn)細胞每個代次之間的尿素生成保持穩(wěn)定。白蛋白分泌是肝細胞特有的功能，不同代次之間白蛋白分泌穩(wěn)定。說明Large T永生化保持細胞的合成與解毒功能也相對穩(wěn)定。見表3。

二、采用分化培養(yǎng)基M7對iHepLPC進行分化

iHepLPC細胞建立好后進行分化，分化以后肝臟功能基因有了顯著上調(diào)。同時檢測了M7分化以后的iHepLPC細胞的尿素生成，Alb分泌水平，發(fā)現(xiàn)合成與解毒功能有了顯著的提高。見表4。

三、小豬急性肝衰竭血漿對細胞毒性實驗

分化后iHepLPC細胞的活率逐漸降低，6 h后細胞活率降到50%左右(圖1A)，但是反映細胞解毒功能的尿素生成不斷增加(圖1B)，同時Alb分泌水平隨著時間而不斷增加(圖1C)，這說明分化后iHepLPC對于肝衰竭血漿不僅具有一定的耐受性還發(fā)揮解毒與合成功能。

表2 不同代次細胞的增殖能力比較(±s)

表3 不同代次間細胞功能基因和尿素生成、白蛋白比較(±s)

表4 分化前后功能基因、尿素，白蛋白比較(±s)

圖1急性肝衰竭血漿對分化后iHepLPC的影響 A：急性肝衰竭血漿對分化后iHepLPC活率的影響；B：急性肝衰竭血漿對分化后iHepLPC尿素合成；C：急性肝衰竭血漿對分化后iHepLPC白蛋白合成分泌變化

討 論

種子細胞是生物人工肝支持系統(tǒng)的靈魂，細胞功能的好壞直接關(guān)系到生物人工肝的治療效果。人肝母細胞瘤細胞系C3A雖然具有蛋白分泌功能，然而它們?nèi)狈δ蛩匮h(huán)的相關(guān)基因，表現(xiàn)出尿素生成和氨清除能力下降[3]。體外肝臟輔助裝置(ELAD)可測試C3A細胞的功能，然而，裝載有C3A細胞的ELAD系統(tǒng)的臨床療效有限，不能顯著延長患者的生存期[4]。將人原代肝細胞轉(zhuǎn)化為永生化前體樣細胞(iHepLPC)可使人原代肝細胞實現(xiàn)體外快速多代次的增殖。常見的人肝細胞永生化的方法有Large T antigen、hTERT、Cre-loxp等[5]。Large T antige抑制pp2A的磷酸酶活性，實現(xiàn)細胞的無限增殖。本研究采用Large T antige對HepLPC進行永生化，對不同代次的細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖速度、形態(tài)、功能基因以及合成解毒功能保持一致。Large T antige建立的永生化細胞成熟且穩(wěn)定，獲得尿素生成功能強的細胞，在后期的BAL應(yīng)用中可以減輕患者肝性腦病的癥狀。

對于建系好的iHepLPC進行分化，發(fā)現(xiàn)細胞功能可以進一步提高，細胞分化是促進成熟，提高功能的又一有效辦法。分化后的細胞具有更加規(guī)則的細胞形態(tài)，同時解毒與合成功能有了顯著提高。值得提出的是，iHepLPC具有極強的尿素生成與氨清除能力，用于BAL可以顯著減輕肝性腦病的癥狀和體征。

細胞在生物人工肝內(nèi)發(fā)揮需要驗證其對ALF血漿的耐受性以及在ALF血漿中的解毒與合成能力。結(jié)果顯示雖然ALF血漿對iHepLPC有一定的損傷，但是隨著時間的變化細胞在血漿中發(fā)揮一定的解毒與合成功能。

綜上所述，永生化后的iHepLPC不僅可以快速無限增殖還可以在ALF血漿中發(fā)揮解毒與合成功能，其可以成為新的生物人工肝種子細胞。

iHepLPC在ALF血漿體現(xiàn)一定的治療效果，對于慢加急性肝衰竭的治療效果還需要進一步驗證。慢加急性肝衰竭是比較常見的肝衰竭，擴大iHepLPCs的應(yīng)用范圍，造福廣大肝衰竭患者[6, 7]。本實驗采用單一的細胞治療，可以與MSC以及HUVEC共培養(yǎng)提高細胞功能，驗證共培養(yǎng)對ALF血漿的效果[8]。

iHepLPC在小豬ALF血漿實驗上體現(xiàn)出良好的治療效果，然而機體是一個復雜的系統(tǒng)，接下來需要驗證其在急性肝衰竭ALF小豬的治療效果。通過動物實驗研究，驗證其對ALF具有一定的治療效果，為臨床試驗做準備。希望新的細胞源可以為廣大ALF患者帶來福音。