黃瓜CsamiR399b及其靶基因CsUBC24的生物信息學(xué)分析

常懷成，羅未蓉，孫涌棟，李貞霞，王廣印

(河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

黃瓜(Cucumissativus)在蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)中占有極其重要的地位，但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)特別是南方多雨季節(jié)或北方冬春季設(shè)施栽培中，很容易受到環(huán)境因素的影響而授粉受精不良，不能正常膨大，最終導(dǎo)致果實(shí)“化瓜”，嚴(yán)重影響了黃瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)和栽培效益。黃瓜果實(shí)膨大是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，迄今已從生理生化和分子水平進(jìn)行了探索，但是有關(guān)黃瓜果實(shí)膨大的分子機(jī)制仍不清楚。

植物中的miRNA是一類重要的調(diào)控分子，通過(guò)剪切靶mRNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答和新陳代謝等多種功能[1]。研究表明，miRNA參與果實(shí)發(fā)育，在果實(shí)形狀、大小、著色、成熟等方面發(fā)揮了重要作用[2]。Daniel等[3]發(fā)現(xiàn)，miRNA參與甜瓜果實(shí)發(fā)育調(diào)控。Zhang等[4]鑒定了哈密瓜果實(shí)發(fā)育中的miRNA及其靶基因，預(yù)測(cè)miR159、miR164、miR319、miR393和miR396及其靶基因參與了哈密瓜果實(shí)早期發(fā)育。黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控課題組在前期構(gòu)建果實(shí)膨大small RNA文庫(kù)和qRT-PCR分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)miR399b參與黃瓜果實(shí)膨大調(diào)控。已有研究表明，miR399在植物激素響應(yīng)[5]、花期調(diào)控[6-7]和品質(zhì)調(diào)控[8]等方面發(fā)揮重要作用。

本課題組在前期研究中還發(fā)現(xiàn)，黃瓜miR399基因家族的靶基因之一為泛素結(jié)合酶24(Ubiquitin conjugating enzyme E2 24,UBC24)。UBC是泛素-蛋白酶體途徑(UPP)的關(guān)鍵作用酶之一[9]，在種子膨大[10]、果實(shí)成熟調(diào)控[11-13]、光周期調(diào)控[14]、維管分化調(diào)控[15]、DNA修復(fù)[14,16-17]和逆境脅迫響應(yīng)[18-20]等方面發(fā)揮著重要功能。目前，有關(guān)UBC參與黃瓜果實(shí)膨大的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究分析了黃瓜CsamiR399b的序列特征及其表達(dá)特性，并對(duì)靶基因CsUBC24進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)，為深入研究CsamiR399b及其靶基因CsUBC24在黃瓜果實(shí)膨大中的功能及其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院試驗(yàn)基地蔬菜大棚非單性結(jié)實(shí)的高代自交黃瓜全雌系Cs0401為試材，于2018年7月17日分別采取黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房、授粉后5 d果實(shí)(膨大)和未授粉5 d子房(未膨大)樣品，用無(wú)菌水清洗干凈，切碎后液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CsamiR399b序列及表達(dá)分析

從先前建立的small RNA文庫(kù)和miBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)獲得CsamiR399b前體序列及成熟體序列，利用RNA Folding Form(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)在線預(yù)測(cè)CsamiR399b前體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

分別提取黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房、授粉后5 d果實(shí)和未授粉5 d子房樣品的總RNA，使用 Aidlab 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)合成cDNA，以U6為內(nèi)參基因，用TaKaRa公司的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒在ABI PRISM 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)CsamiR399b的表達(dá)特性，引物見(jiàn)表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 CsUBC24的生物信息學(xué)分析

前期通過(guò)降解組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CsamiR399b靶基因?yàn)镃sUBC24。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得靶基因CsUBC24的蛋白質(zhì)序列。使用NPS@:SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析；通過(guò)TMHMM Server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜性預(yù)測(cè)；利用WoLFPSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)、TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對(duì)CsUBC24蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行親疏水性分析；使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；使用 MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析基因序列結(jié)構(gòu)；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsamiR399b序列分析

從small RNA文庫(kù)中獲取了CsamiR399b成熟體序列，長(zhǎng)度為21 nt，從miBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其前體序列。經(jīng)RNA Folding Form預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CsamiR399b基因前體序列具有穩(wěn)定的二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中成熟序列位于基因前體序列的3′端臂上(圖1)。

2.2 CsamiR399b的表達(dá)分析

熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，與開(kāi)花當(dāng)天子房和未授粉5 d子房相比，CsamiR399b在授粉后5 d果實(shí)中表達(dá)量最高，為開(kāi)花當(dāng)天子房的2.5倍，為未授粉5 d子房的4倍(圖2)。這說(shuō)明CsamiR399b的表達(dá)與黃瓜果實(shí)膨大呈正相關(guān)，證實(shí)其參與黃瓜果實(shí)膨大調(diào)控。

劃線部分表示成熟序列。The underlined part is the mature sequences.

A.開(kāi)花當(dāng)天子房; B. 授粉后5 d果實(shí)(膨大); C. 未授粉5 d子房(未膨大)。A. Ovary on the day of anthesis without pollination; B. 5 d fruit after pollination(expansion); C. 5 d ovary without pollination(unexpansion).

2.3 CsUBC24蛋白性狀分析

通過(guò)NPS@:SOPMA分析了黃瓜CsUBC24蛋白序列，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)黃瓜CsUBC24蛋白主要由4種構(gòu)象組成(表2)，其中無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)含有424個(gè)氨基酸，占整體的46.59%，比例最高；其次為α-螺旋(Hh)和延伸鏈(Ee)，分別由246，176個(gè)氨基酸構(gòu)成，占整體的27.03%和19.34%；β-轉(zhuǎn)角(Tt)比例較少，有64個(gè)氨基酸，占整體的7.03%。蛋白質(zhì)的N 端是否帶有信號(hào)肽可判別該蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的信號(hào)肽，其C值和Y值應(yīng)約等于+1，在剪切位點(diǎn)前后S值應(yīng)該呈先上升后下降趨勢(shì)。使用SignalP 5.0對(duì)黃瓜CsUBC24蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析，得到C、Y、S值分別為0.111，0.105，0.121(表2)。可以判斷，CsUBC24蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不是分泌蛋白。

表2 CsUBC24蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)Tab.2 Secondary structure and signal peptide prediction of CsUBC24 protein

分析跨膜蛋白不僅可以了解特定生物膜的功能，而且有助于進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)的定位與功能。經(jīng)蛋白質(zhì)跨膜性預(yù)測(cè)分析，CsUBC24蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，全部在膜外(圖3)。細(xì)胞中蛋白質(zhì)的位置決定了該蛋白質(zhì)的功能。通過(guò)在線軟件TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)黃瓜CsUBC24蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)CsUBC24蛋白位于葉綠體、線粒體或分泌通路的可能性較小(表3)。利用WoLF PSORT Prediction預(yù)測(cè)黃瓜CsUBC24蛋白的分布位置可知，該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核。通過(guò)在線軟件Plant-mPLoc再次驗(yàn)證，確定CsUBC24蛋白定位于細(xì)胞核上。CsUBC24蛋白的親水氨基酸所占比例高達(dá)62.75%，而疏水性氨基酸為36.37%(圖4)。由于親水性區(qū)域所占比例遠(yuǎn)大于疏水性區(qū)域，因此，可以確定CsUBC24蛋白為可溶性蛋白。其中，親水性最強(qiáng)的是第836位的丙氨酸，其值為-2.856。

圖3 CsUBC24蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of transmembrane structure of CsUBC24 protein

表3 CsUBC24蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Tab.3 Prediction of subcellular location of CsUBC24 protein

圖4 CsUBC24蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 The hydrophobicity prediction of CsUBC24 protein

2.4 CsUBC24序列分析

對(duì)CsUBC24蛋白進(jìn)行Blast同源序列比對(duì)，用DNAMAN對(duì)黃瓜CsUBC24以及其同源物種的UBC24氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析CsUBC24蛋白的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，黃瓜CsUBC24蛋白與甜瓜(Cucumismelo)UBC24蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，其次為南瓜(Cucurbitamoschata)和苦瓜(Momordicacharantia)UBC24蛋白(圖5)。

使用SMART分析黃瓜CsUBC24蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)CsUBC24蛋白序列660-817位氨基酸為泛素結(jié)合酶E2結(jié)構(gòu)域(UBCc)，并且含有2個(gè)低成分復(fù)雜區(qū)域(Low complexity region)。同時(shí)使用NCBI在線預(yù)測(cè)CsUBC24的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果與SMART分析結(jié)果基本一致(圖6)，該蛋白質(zhì)同樣屬于UBCc超級(jí)家族，結(jié)構(gòu)域位于660-812位氨基酸。進(jìn)一步對(duì)黃瓜、甜瓜、南瓜和苦瓜UBC24蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)物種均含有UBCc保守域，且由數(shù)量及位置大致相同的氨基酸構(gòu)成，甜瓜、南瓜和苦瓜UBC24蛋白同樣屬于UBCc超級(jí)家族。這說(shuō)明UBC24蛋白在各物種間功能保守。對(duì)黃瓜、甜瓜、南瓜和苦瓜UBC24基因核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsUBC24基因與甜瓜、南瓜和苦瓜UBC24基因結(jié)構(gòu)相似，編碼區(qū)長(zhǎng)度基本相同，因此認(rèn)為該基因的外顯子區(qū)相對(duì)保守。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，UBC24蛋白家族氨基酸序列在整體上基本相同，具有較強(qiáng)的保守性，幾乎含有共同的保守區(qū)域(圖7)。

圖5 UBC24家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of UBC24 family

圖6 CsUBC24蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 The conservative domain prediction of CsUBC24 protein

劃線部分為功能結(jié)構(gòu)域。The underlined part is the functional domain.

3 結(jié)論與討論

miR399家族是一類與植物耐低磷脅迫密切相關(guān)的miRNA家族[21-22]，參與調(diào)節(jié)磷營(yíng)養(yǎng)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)或響應(yīng)低磷脅迫誘導(dǎo)[23-26]。此外還發(fā)現(xiàn)，在野生型草莓(Fragaria×ananassaDuch.)果實(shí)中miR399表達(dá)水平與糖含量呈負(fù)相關(guān)性，其中果實(shí)發(fā)育期間miR399表達(dá)差異顯著[27]，因此其可能參與果實(shí)發(fā)育。本試驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)黃瓜果實(shí)膨大期CsamiR399b的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CsamiR399b在膨大的黃瓜果實(shí)中明顯上調(diào)，證實(shí)CsamiR399b參與黃瓜果實(shí)膨大調(diào)控。本研究豐富了miR399在植物中的功能，為深入研究miR399與果實(shí)膨大的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsamiR399b的靶基因CsUBC24編碼蛋白具有910個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)與小白菜BCUBCE2[28]、龍葵SorUBC[29]和菜心BclUBE2[30]蛋白質(zhì)性狀基本相同，其主要是由無(wú)規(guī)則卷曲與α-螺旋構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)，沒(méi)有信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞核，為可溶性蛋白。黃瓜CsUBC24具有UBC蛋白共有的UBCc結(jié)構(gòu)域，是UBCc超級(jí)家族的成員。黃瓜CsUBC24與甜瓜CmUBC24的同源性最高，其次為南瓜和苦瓜。多序列比對(duì)結(jié)果表明，不同種類植物的UBC24具有較高的相似性和序列保守性，該結(jié)果與Baloglu等[31]的研究結(jié)果相一致。這說(shuō)明UBC家族是一個(gè)高保守基因家族。同一家族中基因的結(jié)構(gòu)較為相似，并有相似的保守元件，那么該家族基因可能具有相似的功能[32]。高保守基因家族在不同植物中通常具有相類似的功能[33]。王園等[11]研究發(fā)現(xiàn)，香蕉果實(shí)躍變成熟后期MaUCE1表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)MaUCE1在果實(shí)成熟與衰老過(guò)程中發(fā)揮作用。高營(yíng)營(yíng)[13]通過(guò)對(duì)葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中VvUBCs的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)VvUBCs在果實(shí)成熟過(guò)程中顯著上調(diào)或下調(diào)，說(shuō)明VvUBCs在葡萄果實(shí)成熟中發(fā)揮了重要作用。據(jù)此推測(cè)，UBC參與調(diào)控植物果實(shí)發(fā)育，且CsamiR399b可能通過(guò)調(diào)控CsUBC24基因表達(dá)參與了黃瓜果實(shí)膨大，本研究為揭示黃瓜果實(shí)膨大機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。要進(jìn)一步確定CsamiR399b及其靶基因CsUBC24在黃瓜果實(shí)膨大中的作用，還需通過(guò)基因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行功能驗(yàn)證。