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    新型糖肽類抗生素B7011對細(xì)菌感染小鼠敗血癥的體內(nèi)抗菌作用研究

    2019-09-02 06:54:50朱珍真郎麗巍王紅艷朱姍薇韓曉彤張翠英曹艷茹魏振滿
    中國抗生素雜志 2019年8期
    關(guān)鍵詞:糖肽敗血癥萬古霉素

    朱珍真 郎麗巍 王紅艷 朱姍薇 韓曉彤 張翠英 曹艷茹 魏振滿,*

    (1 中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部藥物試驗(yàn)中心,北京 100039;2 成都雅途生物技術(shù)有限公司,成都 610041)

    隨著細(xì)菌耐藥程度日趨上升,其中葡萄球菌及腸球菌都具有較高水平的耐藥性[1-2],由其引起的敗血癥、急性肺炎以及皮膚和軟組織感染等嚴(yán)重感染疾病,增加了患者的痛苦[3],針對此類感染,研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。

    目前,萬古霉素、利奈唑胺、達(dá)托霉素等抗生素是臨床上治療耐藥菌感染的常用藥。但是隨之而來的是細(xì)菌對這些藥物的的敏感性呈逐年下降的趨勢,再加之萬古霉素、利奈唑胺等藥物具有較大的毒副作用,使其在臨床上的應(yīng)用受到一定程度的限制[4-5]。

    B7011是成都雅途生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的半合成第二代糖肽類抗生素,本研究的前期試驗(yàn)中,我們檢測了B7011和萬古霉素對目標(biāo)菌株的體外抗菌活性,測得B7011對MSSA、MRSA、VRE的MIC值分別為≤0.125、≤0.125和0.015μg/mL,均顯著低于萬古霉素(1、1和>256μg/mL,表明B7011具有較好的體外抗菌活性。本研究以VRE、MSSA和MRSA感染敗血癥小鼠為動(dòng)物模型,研究B7011對敗血癥小鼠的保護(hù)作用。

    1 試驗(yàn)材料

    1.1 試驗(yàn)藥品

    試驗(yàn)藥:B7011,成都雅途生物技術(shù)有限公司研制;批號(hào):121210-2,效價(jià):97%;對照藥:萬古霉素(vancomycin),美國禮來制藥公司研制;批號(hào):c060864,效價(jià):100%。

    1.2 試驗(yàn)菌株

    革蘭陽性菌3株。其中MSSA為標(biāo)準(zhǔn)菌株,其菌號(hào):ATCC29213;而MRSA以及VRE為臨床分離的耐藥菌株;以上菌株均由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心微生物室提供。

    1.3 培養(yǎng)基與孵育條件[6-7]

    葡萄球菌:恒溫35℃,在M-H培養(yǎng)基中孵育18h;屎腸球菌:恒溫35℃,在含有5%綿羊血的M-H培養(yǎng)基中孵育20~24h。

    1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

    ICR種小鼠,體重控制在18~22g,性別見具體實(shí)驗(yàn)方法,由北京市斯貝福試驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供;動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(京)2011-0004;動(dòng)物飼養(yǎng)地點(diǎn):原中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)保障研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào):SYXK(軍)2012-0010。

    1.5 保護(hù)劑

    高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司,生產(chǎn)日期:2013年4月8日。用純化水配置成濃度為5%的混懸液,高壓后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 增毒實(shí)驗(yàn)方法[6-8]

    為了得到可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80%~100%死亡的菌濃度,即最小致死劑量(minimum lethal dose,MLD)菌濃度,需要對致病菌進(jìn)行增毒。增毒方法為:于試驗(yàn)前1d將試驗(yàn)用菌接種于10mL MH液體培養(yǎng)基中,按照“1.3項(xiàng)”所列要求進(jìn)行培養(yǎng)。用保護(hù)劑將培養(yǎng)好的菌原液做10-1、10-2倍稀釋,并對雄性ICR小鼠進(jìn)行腹腔注射,注射劑量為每只0.5mL,注射后觀察。在無菌條件下解剖感染后剛死亡或?yàn)l死小鼠,取心臟血涂于MH固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌,再以此菌繼續(xù)感染小鼠,按此方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)2~3次,得到MLD菌濃度。

    2.2 免疫低下小鼠的建模[6-9]

    由于VRE毒力較弱,故用腹腔注射VRE菌液造成小鼠急性敗血癥時(shí),需在感染前先將試驗(yàn)小鼠制備成免疫低下小鼠,以提高感染的成功率。制備方法為:分別于第1天和第4天,對ICR小鼠進(jìn)行一次皮下注射環(huán)磷酰胺,注射劑量為200mg/kg/次,通過此方法,可以使小鼠的白細(xì)胞值降至100~150×109/L,末次注射環(huán)磷酰胺16h后再腹腔注射感染VRE菌液,可以保證模型對照組的死亡率在80%以上。

    2.3 藥液稀釋方法[10]

    采用孫瑞元介紹的低比值系列稀釋方法,即相臨兩個(gè)劑量組的藥液以0.65~0.7倍進(jìn)行稀釋,一共稀釋6~7個(gè)濃度。藥物劑量可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得。在正式試驗(yàn)中,最高藥物劑量應(yīng)盡量保證感染鼠存活率達(dá)到70%~100%,最低藥物劑量應(yīng)盡量使得感染鼠的存活率低于30%。

    2.4 ED50(50%有效劑量)動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)[6-7]

    將體重為18~20g的ICR種小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組,每組10只,雌雄各半。禁食后,取5%高活性干酵母混懸液配制的MLD濃度的菌液,按每只0.5mL的劑量,以腹腔注射的方式建立感染模型。注射后1h,通過尾靜脈注射給予不同濃度的藥物,劑量為每只0.2mL。感染后連續(xù)觀察7d,記錄各給藥組、陽性對照組以及MLD和0.1 MLD感染組小鼠死亡數(shù),將給藥劑量和對應(yīng)的小鼠死亡數(shù)導(dǎo)入DAS 2.1.1軟件進(jìn)行半數(shù)有效劑量的運(yùn)算,得到試驗(yàn)藥和對照藥的ED50、ED5、ED95,以及兩藥藥效學(xué)參數(shù)比較P值結(jié)果。

    3 結(jié)果

    3.1 對MSSA致小鼠急性感染敗血癥模型的保護(hù)作用

    B7011對MSSA-ATCC 29213致小鼠急性敗血癥模型的保護(hù)作用結(jié)果為:ED50、ED5、ED95值分別為0.722、0.468和1.115mg/kg。陽性對照藥萬古霉素對敏感菌所致敗血癥模型也有較好的保護(hù)作用,其ED50、ED5、ED95值分別為0.764、0.416和1.403mg/kg;比較兩藥的保護(hù)作用,統(tǒng)計(jì)結(jié)果P=0.645,提示差異無統(tǒng)計(jì)意義。表明B7011對MSSA所致小鼠急性敗血癥模型的體內(nèi)保護(hù)作用與陽性對照藥萬古霉素相似。具體數(shù)值見表1~2。

    3.2 對MRSA致小鼠急性感染敗血癥模型的保護(hù)作用

    B7011對MRSA- C118致小鼠急性敗血癥模型的保護(hù)作用結(jié)果為:ED50、ED5、ED95值分別為0.193、0.045和0.82mg/kg,陽性對照藥萬古霉素組的感染動(dòng)物死亡數(shù)量明顯多于試驗(yàn)藥組,其ED50、ED5、ED95值分別為:0.374、0.092和1.515mg/kg;比較兩藥的保護(hù)作用,統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)意義,由此可見,針對耐藥菌感染所致的小鼠急性敗血癥模型,新型糖肽類抗生素B7011的體內(nèi)保護(hù)作用明顯優(yōu)于萬古霉素。具體數(shù)值見表1~2。

    3.3 對VRE致小鼠感染敗血癥模型的保護(hù)作用

    B7011對VRE-No.5所致小鼠急性敗血癥模型的保護(hù)結(jié)果為:ED50、ED5、ED95值分別為0.395、0.046和3.429mg/kg,而該致病菌對陽性對照藥萬古霉素產(chǎn)生了明顯的耐藥性,導(dǎo)致即使提高了萬古霉素的給藥劑量,但動(dòng)物的死亡數(shù)量仍然較多。萬古霉素對VRE的ED50、ED5、ED95值分別為1.547、0.079和30.168mg/kg;兩藥統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P值<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)意義。說明B7011對VRE所致小鼠急性敗血癥模型體內(nèi)保護(hù)作用明顯優(yōu)于萬古霉素。具體數(shù)值見表1~2。

    4 討論

    B7011是成都雅途生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的半合成第二代糖肽類抗生素。與其他糖肽類抗生素相似,B7011的藥理作用為:與處于分裂期的細(xì)胞壁肽聚糖前體末端的氨基酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)合,以此阻礙細(xì)胞壁的合成,從而起到抑制并殺滅細(xì)菌的作用[11-12]。不同的是,B7011在糖基側(cè)鏈中加入了一條飽和烴基鏈,長度為11個(gè)碳原子,這一脂肪鏈的引入起到了大幅增加B7011半衰期的作用,而且還有利于藥物分子與致病菌細(xì)胞膜的錨定,從而增加了B7011的抗菌活性。

    前期的體外試驗(yàn)結(jié)果表明B7011抗菌譜主要為革蘭陽性菌。本研究檢測了B7011和萬古霉素對目標(biāo)菌株的體外抗菌活性,測得B7011對MSSA、MRSA、VRE的MIC值分別為≤0.125、≤0.125和0.015μg/mL,均顯著低于萬古霉素(1、1和>256μg/mL)。

    表1 對3株菌所致小鼠急性敗血癥模型各組給藥劑量及給藥后動(dòng)物死亡數(shù)量表Tab.1 Drug dosage for acute septicemia induced by three strains of bacteria and mortality of animals after administration

    表2 B7011及萬古霉素對革蘭陽性球菌所致小鼠敗血癥模型保護(hù)作用的藥效學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacodynamic parameters of the protective effect of B7011 and vancomycin against systemic infections in mice caused by Gram-positive cocci

    基于此,本研究開展了B7011體內(nèi)抗菌作用研究。利用臨床常見的革蘭陽性菌急性感染ICR小鼠來制備敗血癥動(dòng)物模型,給與不同劑量的藥物,比較B7011和藥性對照藥萬古霉素對敗血癥小鼠的保護(hù)作用。從已完成的ED50動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果可以看出:B7011可以降低臨床常見致病菌急性感染的敗血癥小鼠的死亡數(shù)量,特別是對萬古霉素已經(jīng)產(chǎn)生耐藥的菌株,其保護(hù)作用尤為顯著。結(jié)合體外試驗(yàn)數(shù)據(jù),我們可以期待新型糖肽類抗生素B7011有望成為臨床上應(yīng)用于耐藥菌感染的具有較好療效的藥物。目前該藥已成功申請臨床試驗(yàn)批件,將對其安全性、有效性和藥動(dòng)學(xué)特征等方面進(jìn)行全面的研究與評估。

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