頭孢洛扎硫酸鹽制備方法的改進(jìn)

周軍榮

(浙江東邦藥業(yè)有限公司，臨海 317016)

頭孢洛扎硫酸鹽(ceftolozane sulfate)是由Astellas Pharma研制，并于2007年由Calixa Therapeutics獲得其開(kāi)發(fā)權(quán)。2009年12月Cubist Pharmaceuticals將Calixa Therapeutics收購(gòu)，獲得頭孢洛扎硫酸鹽(又稱CXA-101)，以及CXA-201(ceflolozane/tazobactam)聯(lián)合用藥的開(kāi)發(fā)及商業(yè)化權(quán)利[1-3]。其中，頭孢洛扎硫酸鹽的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 頭孢洛扎硫酸鹽的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of ceftolozane sulfate

而頭孢洛扎是一種新型靜脈給藥的“第五代”頭孢菌素類抗生素，其耐受性良好，抗菌譜較廣，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌都具有較強(qiáng)的活性，在體內(nèi)外試驗(yàn)中對(duì)銅綠假單胞菌以及多重耐藥銅綠假單胞菌均顯示出強(qiáng)效的抗菌活性[4-5]。且頭孢洛扎與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑tazobactam組成復(fù)方靜脈注射劑，于2014年12月獲得了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準(zhǔn)上市，商品名為Zerbaxa?，是第四個(gè)被FDA批準(zhǔn)，并指定為合格的感染疾病產(chǎn)品(QIDP)的新抗菌藥產(chǎn)品，獲得現(xiàn)有抗生素激勵(lì)(GAIN)法規(guī)規(guī)定的為期5年的專營(yíng)權(quán)延長(zhǎng)，呼吸機(jī)相關(guān)性細(xì)菌性肺炎(VABP)和醫(yī)院獲得性細(xì)菌性肺炎(HABP)的治療正進(jìn)行Ⅲ期臨床研究[6]。該品上市后為臨床上治療多重耐藥菌的感染提供新的選擇。

目前，也有相關(guān)專利及文獻(xiàn)報(bào)道了頭孢洛扎硫酸鹽的合成方法[7-9]。方法總結(jié)如下：

合成方法1(圖2)：首先將二苯甲基保護(hù)的母核結(jié)構(gòu)作為起始原料之一，7-位側(cè)鏈噻二唑化合物首先用Boc保護(hù)氨基后，再用三氯氧磷將羧基活化為酰氯，之后與上述的母核進(jìn)行縮合反應(yīng)得到中間體化合物；然后再與側(cè)鏈吡唑化合物進(jìn)行反應(yīng)，最后經(jīng)過(guò)脫保護(hù)反應(yīng)制得頭孢洛扎三氟乙酸鹽，但是脫保護(hù)反應(yīng)的摩爾收率很低，只有約5%；頭孢洛扎三氟乙酸鹽再經(jīng)過(guò)過(guò)柱純化制得頭孢洛扎硫酸鹽，合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 頭孢洛扎硫酸鹽的合成路線1Fig.2 Synthetic route 1 of ceftolozane sulfate

合成方法2(圖3)：是以將母核與7-位側(cè)鏈噻二唑化合物縮合反應(yīng)完的化合物為起始原料，再與側(cè)鏈吡唑化合物進(jìn)行反應(yīng)，側(cè)鏈吡唑化合物上的氨基先用三苯甲基進(jìn)行保護(hù)。最后進(jìn)行的脫保護(hù)反應(yīng)收率比較低，得到的頭孢洛扎三氟乙酸鹽經(jīng)過(guò)過(guò)柱純化得到頭孢洛扎硫酸鹽，合成路線如圖3所示。

合成方法3(圖4)：與上述報(bào)道的兩種制備方法的合成路線有所不同，首先將側(cè)鏈吡唑化合物與對(duì)甲氧基芐基(PMB)保護(hù)的母核進(jìn)行反應(yīng)得到中間體化合物，之后與7-位側(cè)鏈噻二唑化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)得到產(chǎn)物。該方法是以水楊醛亞胺頭孢菌素衍生物為起始原料。其首先與用三苯甲基進(jìn)行保護(hù)的側(cè)鏈吡唑化合物進(jìn)行反應(yīng)得到水楊醛亞胺吡唑中間體化合物。之后7-位側(cè)鏈噻二唑化合物活化成甲磺酸酐化合物與上述中間體化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)，之后使用三氟乙酸/苯甲醚體系進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到頭孢洛扎三氟乙酸鹽，最后將其過(guò)柱純化為頭孢洛扎硫酸鹽。其中脫保護(hù)反應(yīng)的的摩爾收率較低，只有約15%，而且文獻(xiàn)報(bào)道中的最后一步純化反應(yīng)沒(méi)有給出具體收率，合成路線如圖4所示。

圖3 頭孢洛扎硫酸鹽的合成路線2Fig.3 Synthetic route 2 of ceftolozane sulfate

圖4 頭孢洛扎硫酸鹽的合成路線3Fig.4 Synthetic route 3 of ceftolozane sulfate

上述報(bào)道中的3種制備頭孢洛扎硫酸鹽的方法，其總收率均較低，而且純化步驟均使用了過(guò)柱的方法，限制工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。所以，改進(jìn)頭孢洛扎硫酸鹽的制備方法，使之能夠工業(yè)化生產(chǎn)，具有較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。參考以上這些合成方法，改進(jìn)后的合成路線如圖5所示，具體步驟如下：首先7-位側(cè)鏈噻二唑化合物TATD與草酰氯反應(yīng)制得化合物1，再與對(duì)甲氧基芐基保護(hù)的母核ACLE·HCl進(jìn)行縮合反應(yīng)得到化合物2，然后化合物2與側(cè)鏈吡唑化合物進(jìn)行反應(yīng)，并在三氟乙酸/苯甲醚條件下進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)得到化合物3，最后經(jīng)過(guò)純化析晶得到頭孢洛扎硫酸鹽。改進(jìn)后的工藝最后純化過(guò)程是不需要過(guò)柱的，即可制得頭孢洛扎硫酸鹽。本文提供的方法不僅提高了各中間體收率，降低了生產(chǎn)成本，而且不需要過(guò)柱子的操作，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與藥品

實(shí)驗(yàn)儀器Varian 400-MR型核磁共振波普儀，梅特勒托利多FE28-Standard實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式pH計(jì)酸度計(jì)，Agilent 1200/1260高效液相色譜儀，AR1140電子天平，ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀等。

主要原料母核ACLE·HCl(上海喬木化學(xué)科技有限公司)，7-位側(cè)鏈噻二唑化合物TATD(上海闖欣醫(yī)藥科技有限公司)，側(cè)鏈吡唑化合物UBT(上海闖欣醫(yī)藥科技有限公司)，其它溶劑與試劑均來(lái)源于上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 合成過(guò)程

圖5 改進(jìn)后的頭孢洛扎硫酸鹽合成路線Fig.5 The improved synthetic route of ceftolozane sulfate

1.2.1 化合物1的合成

將TATD(80g,0.242mol,1eq)溶解在400mL二氯甲烷中，并降溫至-12℃。將草酰氯(24.92mL,0.290mol,1.2eq)滴加至反應(yīng)液中，耗時(shí)20min。滴加完畢后，繼續(xù)控溫-12℃，攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液滴加至1.2L異丙醚中，控溫-10～0℃，耗時(shí)2h。之后繼續(xù)控溫-10～0℃，攪拌析晶3h。析晶結(jié)束后，過(guò)濾，得到濕品置于35℃真空干燥，得到干品82.4g化合物1，摩爾收率為97.6%。1H NMR(400MHz,THF-D8)：δ7.59(bs,2H,NH2)，1.52(s,6H,CH3)，1.42(s,9H,CH3)；ESI-MS：m/z348.1[M]+

1.2.2 化合物2的合成

室溫下，將化合物1(70g,0.201mol,1.0eq) 與ACLE-HCl(85g,0.210mol,1.04eq)溶解在500mL乙腈中，溶解完全后降溫至-10℃?？販?-10±2)℃，將吡啶(19.91g,0.252mol,1.25eq)滴加至上述反應(yīng)液，耗時(shí)30min。加完后，反應(yīng)液繼續(xù)控溫(-10±2)℃，攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，用250mL甲苯與200mL 5%稀硫酸的混合液進(jìn)行淬火反應(yīng)，控溫-8℃以下。加完后，將雙相料液升溫至20～25℃，攪拌15min，靜置分層。收集有機(jī)層，并往有機(jī)層中加入200mL 5%稀硫酸水溶液攪拌洗滌，控溫25℃以下。之后控溫25℃，攪拌15min，靜置分層。收集有機(jī)層再依次用150mL的10%氯化鈉溶液與150mL純化水進(jìn)行洗滌，控溫25℃攪拌15min，靜置分層。有機(jī)層濃縮至體積約300mL。將濃縮殘留物料降溫至20℃，并加入晶種?？販?0℃，攪拌析晶2h。之后，往料液里滴加700mL甲苯，耗時(shí)3h，控溫20℃。加完后，繼續(xù)控溫20℃，攪拌2h。過(guò)濾，濾餅依次用200mL乙腈/甲苯混合液洗滌(乙腈為5%，體積比)、300mL甲苯淋洗。將濕品置于真空下，40℃干燥得到128.7g化合物 2，摩爾收率94%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 9.52(d,J=8.5Hz,1H,NH),8.18(bs,2H,NH2),7.36(d,J=8.7Hz,2H,CH),6.94(d,J=8.7Hz,2H,CH),5.90(dd,J=4.9Hz,8.5Hz,1H,CH),5.10～5.28(m,2H+1H,CH2+CH),4.46～4.54(m,J=16Hz,2H,CH2),3.76(s,3H,CH3),3.45～3.70(m,2H,CH2),1.44(s,6H,CH3),1.39(s,9H,CH3); ESI-MS：m/z680.15[M]＋。

1.2.3 化合物3的合成

將化合物2(67g,0.098mol,1eq)，側(cè)鏈吡唑化合物UBT(54.77g,0.101mol,1.03eq)溶解在570mL四氫呋喃中?？販? 5 ℃，分6 ～8 次加入碘化鉀22.7g(0.137mol,1.4eq)，攪拌反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮至體積約300mL。通過(guò)在蒸餾過(guò)程中以恒定速率加入450mL乙酸乙酯進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換以除去四氫呋喃，以保持約300mL的料液體積。之后，往反應(yīng)液里依次加入350mL乙酸乙酯，180mL的10%氯化鈉溶液，控溫15℃攪拌30min，靜置分層。分層得到有機(jī)層，濃縮至體積約為300mL?？販?0～20℃，先往反應(yīng)液料液中加入100mL苯甲醚，再緩慢滴加入400mL三氟乙酸(TFA)，滴加耗時(shí)1h。加完之后，控溫20℃攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，降溫至5℃，往料液中滴加入600mL甲基叔丁基醚，耗時(shí)2h。之后控溫5℃攪拌1h，過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚200mL洗滌，濕品置于真空35℃條件下，干燥得到68.8g化合物3，摩爾收率90%。ESI-MS：m/z667.2[M]+。

1.2.4 頭孢洛扎硫酸鹽的合成

控溫20～25℃，將化合物3(50g,0.064mol)與350mL混合溶劑(乙腈:水=1:1,V/V)攪拌混合均勻。之后降溫至15℃，往料液中緩慢滴加50%稀硫酸12.5g，控溫15～20℃，pH0.1～1.0，攪拌至料液溶清。料液經(jīng)過(guò)0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾，并將濾液降溫至12℃。往料液中加入適量頭孢洛扎硫酸鹽晶種，反應(yīng)液控溫12℃繼續(xù)攪拌析晶3h。控溫12℃，將400mL乙腈緩慢滴加至反應(yīng)液中，耗時(shí)2h。滴加完后，將用三乙胺(5.33g,1.0eq,7.35mL)加至反應(yīng)液中，調(diào)節(jié)pH(1.5～3.0)，之后反應(yīng)液繼續(xù)攪拌3h。過(guò)濾，濾餅用100mL混合溶劑(乙腈:水=4:1,V/V)與80mL丙酮淋洗。濕品在真空下，30℃干燥得到46.5g頭孢洛扎硫酸鹽，摩爾收率95%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ 7.89(s,1H,CH),5.85(d,J=4.8Hz,1H,CH),5.23(d,J=4.8Hz,1H,CH),5.19(d,J=14.7Hz,1H,CH2),4.96(d,J=14.7Hz,1H,CH2),3.70(s,3H,CH3),3.47(t,J=5.8Hz,1H,CH2),3.45(d,J=17.5Hz,1H,CH2),3.21(d,J=17.8Hz,1H,CH2),3.13(t,J=5.7Hz,1H,CH2),1.52(s,3H,CH3),1.51(s,3H,CH3); ESI-MS：m/z667.2[M]＋；IR(KBr)3353,3183,1778,1652,1558,1403,1321,1143,1118,997,619 cm-1。

2 分析討論

2.1 化合物1的合成

該步驟主要是將7-位側(cè)鏈噻二唑化合物TATD進(jìn)行活化，將其羧基轉(zhuǎn)化成酰氯，使之更容易與母核ACLE·HCl進(jìn)行縮合反應(yīng)，提高收率及純度。嘗試過(guò)文獻(xiàn)專利報(bào)道的甲磺酰氯或者三氯氧磷進(jìn)行活化反應(yīng)，但是收率均較低。該步驟反應(yīng)使用草酰氯進(jìn)行酰氯化反應(yīng)，操作比較簡(jiǎn)單，最終得到的產(chǎn)物純度及收率均較高，關(guān)鍵是保證反應(yīng)是無(wú)水條件，否則草酰氯遇水會(huì)分解，導(dǎo)致收率及純度降低。反應(yīng)結(jié)束后，將料液加至異丙醚中，速度不能過(guò)快，否則析出來(lái)的固體會(huì)團(tuán)聚，無(wú)法正常析出。

2.2 化合物2的合成

將以母核ACLE·HCl與7-位側(cè)鏈化合物1為起始原料，在縛酸劑吡啶的存下，進(jìn)行縮合反應(yīng)得到化合物2。研究該反應(yīng)時(shí)，使用不同的縛酸劑(各種有機(jī)堿包括吡啶、三乙胺、二乙胺、二異丙胺、哌啶及吡咯)對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響，具體見(jiàn)表1。最后發(fā)現(xiàn)，使用吡啶作為縛酸劑時(shí)，反應(yīng)得到的產(chǎn)物的收率及純度經(jīng)綜合考慮是最佳的。該反應(yīng)采用了多次洗滌，是為了去除料液中多余的有機(jī)堿及反應(yīng)生成的鹽，使得到的化合物2純度更高。最后將甲苯緩慢滴加至料液中，滴加速度一定緩慢，否則會(huì)出現(xiàn)爆析的現(xiàn)象，降低產(chǎn)品純度。

2.3 化合物3的合成

化合物2與側(cè)鏈吡唑化合物UBT反應(yīng)時(shí)，需要催化劑碘化鉀存在下，才可反應(yīng)得較完全。碘化鉀必須少量多次加，一次性加入反應(yīng)效果不佳，原料殘留較大。反應(yīng)得到的過(guò)渡態(tài)再使用三氟乙酸/苯甲醚體系進(jìn)行脫保護(hù)基反應(yīng)，能夠得到純度與收率較高的產(chǎn)品。研究該脫保護(hù)基反應(yīng)時(shí)，使用不同反應(yīng)體系，比如氯化氫及四氯化鈦，使用四氯化鈦時(shí)，最終的鈦鹽對(duì)環(huán)境污染較嚴(yán)重，且原料反應(yīng)不完全，導(dǎo)致收率低；使用氯化氫時(shí)，由于酸性比較強(qiáng)，反應(yīng)比較劇烈，脫去保護(hù)基的同時(shí)，可發(fā)生頭孢母核3位和4位基團(tuán)裂解的反應(yīng)，容易產(chǎn)生副產(chǎn)物和雜質(zhì)，影響了產(chǎn)品的純度。后期反應(yīng)得到化合物3，可在有機(jī)溶劑中析出，使用異丙醚與甲基叔丁基醚。在異丙醚體系中析出的固體較黏，容易成團(tuán)，無(wú)法正常析出；而在甲基叔丁基醚體系中析出的晶型更好，顆粒分散得較均勻，最終得到的產(chǎn)品純度也較高。

2.4 頭孢洛扎硫酸鹽的合成

文獻(xiàn)報(bào)道的方法均需要通過(guò)分離柱，才能純化合成頭孢洛扎硫酸鹽。過(guò)柱操作直接影響了大規(guī)模生產(chǎn)。而本實(shí)驗(yàn)方法則采取了常用的混合溶劑中析晶方式純化，最后能夠得到較高純度的產(chǎn)品。該步驟反應(yīng)的關(guān)鍵在于調(diào)節(jié)析晶時(shí)pH值，具體見(jiàn)表2。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)析晶體系長(zhǎng)期處于pH＜1.5時(shí)，產(chǎn)品純度較低，分析其原因可能是在強(qiáng)酸性體系，頭孢母核發(fā)生裂解反應(yīng)，容易產(chǎn)生雜質(zhì)，pH值較低時(shí)，析晶也比較快，也會(huì)影響產(chǎn)品的純度；當(dāng)析晶體系長(zhǎng)期處于pH＞3.0時(shí)，產(chǎn)品純度與收率均比較低，分析其原因可能是pH值較高時(shí)，頭孢母核上的雙鍵可能發(fā)生異構(gòu)，容易產(chǎn)生異構(gòu)體雜質(zhì)，影響純度及收率，也有可能部分游離的頭孢洛扎未成鹽也會(huì)影響收率。對(duì)于該反應(yīng)，使用了有機(jī)堿三乙胺調(diào)節(jié)pH值。考察過(guò)使用碳酸鉀或碳酸鈉等無(wú)機(jī)堿與二乙胺、三乙胺、哌啶及吡啶等有機(jī)堿，具體見(jiàn)表3，結(jié)果使用三乙胺時(shí)，產(chǎn)品的純度及收率綜合考慮是最佳的。

表2 不同pH值對(duì)合成頭孢洛扎硫酸鹽的影響Tab.2 Effect of different pH values on synthesis of ceftolozane sulfate

表3 不同堿對(duì)合成頭孢洛扎硫酸鹽的影響Tab.3 Effect of different bases on synthesis of ceftolozane sulfate

3 結(jié)論

以7-位側(cè)鏈噻二唑化合物TATD為起始原料，與草酰氯反應(yīng)得到化合物1；再與起始原料母核ACLE·HCl進(jìn)行縮合反應(yīng)得到化合物2；然后化合物 2與起始原料側(cè)鏈吡唑化合物UBT進(jìn)行反應(yīng)，并在三氟乙酸/苯甲醚體系下進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)得到化合物3；最后經(jīng)過(guò)析晶方式純化得到頭孢洛扎硫酸鹽。該工藝得到頭孢洛扎硫酸鹽的收率較高，所用原料易得，降低了生產(chǎn)成本，純化時(shí)不需要過(guò)柱，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，整個(gè)工藝路線具有較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。