銀杏酸C17:1衍生物增效達(dá)托霉素抗糞腸球菌的發(fā)現(xiàn)與機(jī)制的初步研究

陸璐 翟貫星 王金鑫 金慧子 李慧梁,* 陳代杰

(1 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；3 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；4 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

近年來(lái)，抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥嚴(yán)重威脅著人類的健康生活，引起了全球關(guān)注。新型化學(xué)合成或微生物來(lái)源的抗生素相對(duì)匱乏，因此，人們?cè)噲D從中草藥中尋找具有抗菌活性或是增效作用的化學(xué)物質(zhì)。銀杏具有多種生理活性作用，已被廣泛用于臨床。銀杏中主要存在3類活性物質(zhì)，分別是銀杏內(nèi)酯、銀杏黃酮以及銀杏酸。銀杏酸具有細(xì)胞毒性[1-3]，很多不良反應(yīng)與之相關(guān)，我國(guó)對(duì)于銀杏藥物質(zhì)量的控制指標(biāo)是銀杏酸含量低于百萬(wàn)分之十[4]，但是銀杏酸在抗菌[5]、抗炎[6]、殺蟲(chóng)等方面具有很好的活性，也可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)[7-8]。目前有大量研究將熊果酸、大黃素等天然產(chǎn)物和抗生素聯(lián)用抗菌取得了不錯(cuò)的進(jìn)展[9]，但是將銀杏酸作為一種抗菌增效劑[10]和抗生素聯(lián)用進(jìn)行研究的文獻(xiàn)基本沒(méi)有，銀杏酸的抗菌研究還只停留在單獨(dú)作用[11-14]。

銀杏酸存在于銀杏的葉、果、外種皮中，其中外種皮的含量最高[15]。銀杏酸由5種同系物組成，銀杏酸C17:1結(jié)構(gòu)為在水楊酸C6位連接含有17個(gè)碳，1個(gè)雙鍵的長(zhǎng)碳鏈。本文對(duì)銀杏酸C17:1衍生物的抗菌作用以及增效作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

(1)實(shí)驗(yàn)菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300、耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌ATCC51299、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC13883、敏感糞腸球菌ATCC29212、敏感屎腸球菌ATCC35667；臨床分離菌株：耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌臨床株1株、敏感屎腸球菌臨床株5株。

(2)化合物：銀杏酸C17:1、銀杏酸C17:1衍生物Ⅰ、銀杏酸C17:1Ⅱ、達(dá)托霉素均購(gòu)于湖北健源化工有限公司。

(3)主要試劑：腦心浸出液肉湯(BHI)購(gòu)于北京三藥科技開(kāi)發(fā)有限公司、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(LB)購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司、活性氧試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 銀杏酸C17:1衍生物的合成

取銀杏酸C17:1(2.0g,5.34mmol)溶于25mL乙醚中，0℃條件下分批次加入氫化鋁鋰(304mg,8.01mmol)，室溫?cái)嚢?2h。反應(yīng)結(jié)束后，0℃條件下緩慢滴加鹽酸水溶液(1mol/L)，使反應(yīng)體系pH=3～4，再用乙酸乙酯萃取(25mL，3次)，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗，并用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓旋干后得到衍生物I 1.8g(4.97mmol，純度93%)。

取銀杏酸C17:1衍生物I(1.0g,2.77mmol)溶于5mL甲醇中，分別加入氯化鈀(49.1mg,0.277mmol)聚甲基硅氫氧烷[0.55mL,8.31mmol(以單體估算)]。反應(yīng)體系升至40℃，并在該溫度下加熱24h。反應(yīng)結(jié)束后體系降至室溫，將體系減壓旋干，直接進(jìn)行柱層析分離(PE/EA,10:1)得到衍生物II854mg(2.47mmol，純度89%)。

1.2.2 銀杏酸C17:1的結(jié)構(gòu)表征

測(cè)定銀杏酸C17:1衍生物Ⅰ和Ⅱ的熔點(diǎn)、質(zhì)譜(ESI.MS)和核磁共振譜(13C NMR、DEPT 90和135)，并將其與銀杏酸C17:1的波譜數(shù)據(jù)比較，對(duì)銀杏酸C17:1衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.2.3 菌懸液的制備

按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)指南(CLSI)提供的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：首先配制所需固體培養(yǎng)基進(jìn)行鋪板，然后從-80℃冰箱取甘油管在固體平板上劃線活化，于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，再挑取單菌落至含1mL液體培養(yǎng)基的試管，將其置于轉(zhuǎn)速220r/min、37℃的搖床中培養(yǎng)12～16h，用培養(yǎng)基稀釋至菌落數(shù)為107CFU/mL數(shù)量級(jí)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 聯(lián)合抗耐藥菌作用的測(cè)定

參考CLSI 2012標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，采用微量肉湯稀釋法，針對(duì)各種致病菌選用臨床上常用的抗生素和衍生物聯(lián)用。運(yùn)用棋盤(pán)法分別測(cè)定銀杏酸C17:1及其衍生物Ⅰ、Ⅱ與抗生素的聯(lián)合抗菌作用。主要過(guò)程是選定4μg/mL化合物的濃度聯(lián)合抗生素，參照CLSI M07-A9[16]標(biāo)準(zhǔn)制備倍比稀釋的抗菌藥物，以含單一抗生素的培養(yǎng)液為陽(yáng)性對(duì)照，不接種細(xì)菌的培養(yǎng)物為陰性對(duì)照，將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h后，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況[17]，并判讀藥物單獨(dú)的最低抑菌濃度(MIC)，計(jì)算兩者聯(lián)用的部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)，其 計(jì) 算 公 式 為：F I C I=M I CA聯(lián)用/MICA單獨(dú)+MICB聯(lián)用/MICB單獨(dú)，其中MICA聯(lián)用和MICB聯(lián)用為A和B聯(lián)用時(shí)MIC中A和B的濃度；MICA單獨(dú)和MICB單獨(dú)即為A和B單用時(shí)各自的MIC；A為銀杏酸C17:1或是其衍生物Ⅰ、Ⅱ，B為抗生素。判斷聯(lián)用效果的標(biāo)準(zhǔn)為：FICI≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FICI≤4，無(wú)關(guān)作用；FICI＞4，拮抗作用[18]。

1.2.5 時(shí)間殺菌曲線測(cè)定

將過(guò)夜培養(yǎng)的耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌ATCC 51299按照1:10000的比例接入含4mL液體培養(yǎng)基的試管中并向試管中分別加入16μg/mL達(dá)托霉素，4μg/mL衍生物II+2μg/mL達(dá)托霉素，4μg/mL衍生物II+4μg/mL達(dá)托霉素，4μg/mL衍生物II+8μg/mL 達(dá)托霉素，4μg/mL衍生物II+16μg/mL達(dá)托霉素，同時(shí)以不加任何藥物和只加衍生物II的做空白對(duì)照組，在0、2、4、6、8和24h進(jìn)行定量取樣。將取出的菌液依次10倍稀釋，分別選取合適的稀釋倍數(shù)的稀釋液100μL；涂布于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板上，且每個(gè)稀釋度涂布2～3個(gè)平行板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～20h，進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)，以菌落形成單位(colony-forming units,CFU)表示。將各培養(yǎng)管菌落計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間在直角坐標(biāo)作圖得到時(shí)間殺菌曲線，評(píng)價(jià)組合藥物的殺菌效力[19]。

1.2.6 Zeta電位測(cè)定

細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后離心，用PBS洗滌并重懸至細(xì)菌的濃度為1×109CFU/mL，4μg/mL達(dá)托霉素和GADII混合藥液作為實(shí)驗(yàn)組，只加達(dá)托霉素或只加衍生物II的作為對(duì)照組，細(xì)菌與藥物在37℃、100r/min下孵育20min，然后進(jìn)行Zeta電位測(cè)定。

1.2.7 活性氧水平的測(cè)定

將耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌模式菌株ATCC 51299接種后培養(yǎng)6～8h左右，用PBS洗滌2次重懸，將探針DCFH-DA(10mmol/L)加入到菌液中至10μmol/L。37℃環(huán)境下孵育20min，無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次，以去除未裝載進(jìn)細(xì)菌的DCFH-DA。在96孔板中用二倍稀釋法配置成不同濃度的達(dá)托霉素和GADII混合藥液以及只加達(dá)托霉素的實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照加入等量的PBS緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照加入Rosup至濃度為15μg/mL，37℃下刺激時(shí)間30min。將菌液轉(zhuǎn)移至96孔板中，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488和525nm。

1.2.8 N-苯基-1-萘胺吸收測(cè)定

細(xì)菌在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)1500g離心10min，洗滌兩次并再懸浮在pH7.4 HEPES緩沖液中，調(diào)整菌落數(shù)至1×107CFU/mL，往準(zhǔn)備好的菌液中加入N-苯基-1-萘胺(NPN)至濃度10μg/mL混勻分裝至96孔板中，96孔板中含有不同濃度的達(dá)托霉素和銀杏酸C17:1衍生物的混合物，孵育1h。用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度變化，熒光的發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)分別設(shè)定為350和420nm。

2 結(jié)果

2.1 銀杏酸C17:1衍生物的合成和結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 銀杏酸C17:1衍生物I的合成和結(jié)構(gòu)表征

衍生物I的MS、NMR波譜數(shù)據(jù)和理化常數(shù)如下：無(wú)色油狀物，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。1H NMR(500MHz,Chloroform-d) δ 7.10(t,J=7.8Hz,1H),6.74(dd,J=7.8,5.2Hz,2H),5.41～5.32(m,2H),4.83(s,2H),2.63～2.53(m,2H),2.04(td,J=7.3,6.1,3.6Hz,4H),1.51(p,J=7.4Hz,2H),1.43～1.20(m,20H),0.95～0.88(t,J=6.9,3H) ppm;13C NMR(126MHz,Chloroform-d) δ 156.16,142.39,129.87,129.85,129.23,121.69,120.58,114.08,66.08,33.31,31.97,30.11～28.33(6C) 27.22,26.92,22.70,22.66,22.34,14.11,14.00ppm; HRMS(m/z):[M+H]+calcd for [C24H41O2]+361.5900; found 361.5907。

2.1.2 銀杏酸C17:1衍生物II的合成和結(jié)構(gòu)表征

衍生物IIMS、NMR波譜數(shù)據(jù)和理化常數(shù)如下：白色粉末，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。1H NMR(500MHz,Chloroform-d) δ 6.99(t,J=7.8Hz,1H),6.75(dd,J=7.6,1.2Hz,1H),6.63(dd,J=8.0,1.2Hz,1H),4.83(s,1H),2.67～2.51(m,2H),2.20(s,3H),1.64～1.47(m,2H),1.47～1.17(m,28H),0.89(t,J=6.9Hz,3H) ppm;13C NMR(126MHz,Chloroform-d) δ 153.75,142.96,126.00,121.89,121.61,112.45,33.71,31.92,30.54,29.69-29.65(9C),29.61,29.54,29.35,22.68,14.10,11.07ppm.HRMS(m/z):[M+H]+calcd for [C24H43O]+347.6070; found 347.6077。

2.2 聯(lián)合抗耐藥菌作用

本實(shí)驗(yàn)選用世界衛(wèi)生組織公布的12種致病菌中的5種，這5種菌株均是標(biāo)準(zhǔn)菌株，運(yùn)用棋盤(pán)格法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，在96孔板上分別測(cè)定銀杏酸衍生物Ⅰ、Ⅱ分別與臨床上常用抗生素的聯(lián)合抗菌的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ聯(lián)用達(dá)托霉素抗糞腸球菌具有協(xié)同作用，其FICI值為0.125～0.25，說(shuō)明它具有協(xié)同作用，在此基礎(chǔ)上，我們又對(duì)1株臨床的糞腸球菌和5株屎腸球菌進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)衍生物Ⅱ聯(lián)合達(dá)托霉素只對(duì)糞腸球菌有增效作用，對(duì)屎腸球菌無(wú)增效作用，結(jié)果參見(jiàn)表1。

2.3 時(shí)間殺菌曲線

與空白對(duì)照組相比，4μg/mL濃度的銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ?qū)?xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有很大影響。固定用4μg/mL的銀杏酸衍生物Ⅱ與不同濃度達(dá)托霉素聯(lián)合使用時(shí)，相比較單獨(dú)使用抗生素，它具有殺菌速度快殺菌效果好等特點(diǎn)，16μg/mL達(dá)托霉素作用下的殺菌效果等同于8μg/mL達(dá)托霉素和4μg/mL銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ共同作用，其結(jié)果如圖2所示。

表1 銀杏酸C17:1衍生物Ⅰ、Ⅱ聯(lián)合達(dá)托霉素抗腸球菌的部分抑菌濃度指數(shù)(FICIs)Tab.1 Fractional inhibitory concentration indices(FICIs) of ginkgolic acid derivatives Ⅰ or Ⅱ combined with antibiotic against VRE

2.4 藥物對(duì)Zeta電位的影響

一般細(xì)菌細(xì)胞膜表面電位是負(fù)值，當(dāng)帶正電荷的藥物與其結(jié)合，改變了細(xì)菌細(xì)胞膜表面電位，從而對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。通過(guò)測(cè)定單獨(dú)達(dá)托霉素以及它和銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ共同結(jié)合糞腸球菌的表面電位變化，推測(cè)其對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的作用情況。由圖3可以看出，耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌的表面電位為(-22.3±0.2)mV，4μg/mL濃度衍生物Ⅱ作用于菌體表面電位為(-22.6±0.2)mV，但當(dāng)4μg/mL濃度衍生物Ⅱ與不同濃度的達(dá)托霉素共同作用菌體后的表面電位低于單獨(dú)達(dá)托霉素作用時(shí)的電位，這說(shuō)明衍生物Ⅱ的增效作用可能與其他因素相關(guān)。

圖2 銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ聯(lián)合達(dá)托霉素對(duì)ATCC 51299的時(shí)間殺菌曲線Fig.2 Time-kill curve established for daptomycin,ginkgolic acid derivatives Ⅱ and the combination against ATCC 51299

2.5 藥物對(duì)耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響

大量文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌接觸殺菌性抗生素后能夠產(chǎn)生活性氧是抗生素殺菌的一個(gè)重要的機(jī)制，我們的研究發(fā)現(xiàn)：達(dá)托霉素能夠使細(xì)菌產(chǎn)生活性氧，且隨著濃度的增加而增加，而在相等的濃度下，加入4μg/mL濃度的衍生物Ⅱ，能夠顯著地增加細(xì)菌產(chǎn)生活性氧(圖4)，推測(cè)其與增效作用有關(guān)。

2.6 N-苯基-1-萘胺攝取檢測(cè)

在疏水性的環(huán)境下，NPN能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，但是在水中它的熒光極低。當(dāng)藥物作用細(xì)菌，改變細(xì)胞膜的通透性，NPN能夠順利進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)，其在胞內(nèi)疏水性環(huán)境下能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。為此，本文研究了衍生物Ⅱ增效達(dá)托霉素抗萬(wàn)古霉素腸球菌的作用，是否與增加細(xì)菌細(xì)胞的通透性，進(jìn)而增加胞內(nèi)抗生素的濃度有關(guān)。其結(jié)果如5所示 ，不同濃度的達(dá)托霉素中分別添加4μg/mL濃度的衍生物Ⅱ時(shí)其相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著增加，推測(cè)衍生物Ⅱ可能在一定程度上增加了細(xì)胞膜的通透性。

圖3 銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ聯(lián)合達(dá)托霉素作用于ATCC51299的Zeta電位的變化Fig.3 The effect of daptomycin,ginkgolic acid derivatives Ⅱ and the combination on zeta potential after treating ATCC 51299

圖4 銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ聯(lián)合達(dá)托霉素作用細(xì)菌胞內(nèi)ROS水平的變化Fig.4 The effect of daptomycin,ginkgolic acid derivatives Ⅱ and the combination on the production of ROS in bacterial cells

圖5 銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ聯(lián)合達(dá)托霉素作用于ATCC51299后NPN熒光強(qiáng)度的變化Fig.5 The fluorescence intensity of daptomycin,ginkgolic acid derivatives Ⅱ and the combination after treating ATCC51299

3 討論

抗菌增效劑具有減少抗生素使用量從而減輕藥物副作用和不易產(chǎn)生耐藥菌株等優(yōu)點(diǎn)。尋找新型的抗菌增效劑來(lái)應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性是有效的方法之一[20]。天然產(chǎn)物來(lái)源廣泛、種類繁多，是抗菌增效劑的一個(gè)寶庫(kù)[21]。銀杏酸含量是銀杏制劑的重要控制指標(biāo)，過(guò)量的銀杏酸會(huì)導(dǎo)致很多不良反應(yīng)，本文對(duì)銀杏酸C17:1進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，需要進(jìn)一步探究其衍生物的毒性作用。銀杏酸C17:1衍生物Ⅱ?qū)_(dá)托霉素具有很好的增效作用，與其改變了細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。細(xì)胞膜通透性的改變是否在一定程度上使得更多的達(dá)托霉素透過(guò)細(xì)胞膜從而殺滅細(xì)菌，需要進(jìn)一步探究。