Erbin在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系*

王璐瑤 于佳樂 劉帥瑩 董彩鳳 白春英 張俊毅

食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）在中國是一種常見的上消化道惡性腫瘤。根據(jù)GLOBOCAN 2018 估計(jì)［1］，食管癌的發(fā)病率在全球癌癥排名中位居第七位，而中國的食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的一半。在中國［2］，男性中癌癥發(fā)病率第三位的是食管癌。因此，中國食管癌的防控形勢(shì)非常嚴(yán)重。

支架蛋白（scaffolding protein）Erbin 定位在細(xì)胞連接半橋粒處，屬于LAP（the leucine-rich repeat and PDZ domain protein）家族成員之一。Erbin 最初被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)軸突髓鞘的形成至關(guān)重要［3］。后來發(fā)現(xiàn)Erbin通過與δ-catenin［4］等多個(gè)黏附連接蛋白結(jié)合而對(duì)上皮細(xì)胞極性的維持［5］、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附發(fā)揮重要作用［6］。然而，Erbin 在惡性腫瘤中扮演何種角色尚有爭論。有研究報(bào)道，Erbin 蛋白在肝細(xì)胞肝癌［7］、乳腺癌［8］中表達(dá)增加，并且與腫瘤的組織學(xué)分化程度呈正相關(guān)。相反地，Erbin 也具有抑癌作用。Erbin通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程而顯著降低宮頸癌細(xì)胞的增殖［9］。

本研究利用組織芯片檢測(cè)299例ESCC蠟塊標(biāo)本中Erbin 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Erbin 的表達(dá)在ESCC組織中顯著增高，并且與ESCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與患者資料

299例食管癌患者的標(biāo)本、40例非典型增生的食管上皮組織（18例低級(jí)別和22例高級(jí)別）、47例癌旁正常食管上皮組織（距原發(fā)腫瘤邊界5 cm以上）標(biāo)本均收集自赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科和汕頭市中心醫(yī)院病理科2007年～2011年存檔蠟塊。所有病例術(shù)前均未接受放療和化療。男性233例，女性66例，中位年齡58 歲。按照美國癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）于2017年修訂的腫瘤TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)［10］：Ⅰ期28 例，Ⅱ期137例，Ⅲ期134 例，Ⅳ期0 例；高分化45 例，中分化229例，低分化25例。另外，位于食管上段的腫瘤19例，中段134 例，下段146 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例148例，沒有轉(zhuǎn)移的151例。所有病例均有詳實(shí)的術(shù)后隨訪資料，其生存時(shí)間的計(jì)算是從手術(shù)日期到由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期或到末次隨訪日期為止，且所有死亡患者的死因均與食管癌有關(guān)?；颊咦铋L隨訪時(shí)間為60 個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為26.74 個(gè)月。此外，為了驗(yàn)證免疫組織化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果，本研究另收集了25例冷凍的食管癌及配對(duì)的癌旁正常食管組織用于提取RNA和蛋白。所有標(biāo)本的使用均征得了倫理委員會(huì)同意且患者本人或家屬知情。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制備 組織芯片的制作參考本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)［11］。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 組織芯片被制成4μm連續(xù)切片；二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，切片再經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復(fù)；3%H2O2和非免疫血清分別滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性與非特異性結(jié)合位點(diǎn)，之后切片再與一抗Erbin或δ-catenin在4℃條件下孵育過夜。Erbin抗體（英國Abcam公司，山羊抗人多抗，且針對(duì)人源性Erbin的C端氨基酸設(shè)計(jì)該抗體的免疫原性）的使用滴度為1:100。δ-catenin抗體（英國Abcam公司，兔抗人多抗，且針對(duì)人源性δ-catenin的第1 150位氨基酸殘基到C端設(shè)計(jì)該抗體的免疫原性）的使用滴度為1:100。第二天，切片經(jīng)PBS沖洗后，滴加生物素標(biāo)記的二抗（UltraSensitiveTMSP免疫組織化學(xué)試劑盒，福州邁新生物公司），DAB顯色，蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗做陰性對(duì)照，以排除二抗的非特異性結(jié)合。

1.2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果的判讀 細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕色顆粒被認(rèn)為是陽性信號(hào)。染色強(qiáng)度分為4級(jí)：0：陰性；1：弱染色；2：中度染色；3：強(qiáng)染色。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分為5級(jí)：0：absent；1：1%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：≥76%。對(duì)于陽性染色區(qū)域一致的標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本的總分?jǐn)?shù)是由腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)兩部分的乘積得出，范圍是0～12。當(dāng)切片上的陽性染色區(qū)域不一致時(shí)，每一區(qū)域單獨(dú)評(píng)分并最后相加得出該標(biāo)本的最終分?jǐn)?shù)。例如，標(biāo)本中75%的腫瘤細(xì)胞為中度染色（3×2=6），其余25%的腫瘤細(xì)胞為弱染色（1×1=1），那么該標(biāo)本的最終分?jǐn)?shù)為6+1=7。為了方便統(tǒng)計(jì)，本研究把所有病例分為2組：Erbin：0～1分為陰性表達(dá)組，2～12分為陽性表達(dá)組。δ-catenin的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［11］。

1.2.4 PCR 檢測(cè) 利用TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）提取食管癌組織中的總RNA，然后借助逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（大連TaKaRa生物公司）得到互補(bǔ)DNA。Erbin 引物的設(shè)定來自參考文獻(xiàn)［12］：5′-C ATCTCACCAAACGACCGAC-3′，5′-GAGCCCGCCTT GTAGAGCC-3′。β-actin 引物序列：5′-AGAGCTAC GAGCTGCCTGAC-3′和5′-AGTACTTGCGCTCAGG AGGA-3′。Erbin/β-actin的灰度比值作為Erbin基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白印跡檢測(cè) 組織裂解物用來提取總蛋白。取等量總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜（美國Millipore公司）。隨后PVDF膜與Erbin抗體（1:200；Abcam）在4℃條件下孵育過夜，再與HRP 標(biāo)記的二抗（1:5 000；Santa Cruz）在室溫下孵育2個(gè)小時(shí)，利用ECL化學(xué)發(fā)光并觀察蛋白條帶。利用FluorChem 8900圖像分析系統(tǒng)（美國Alpha公司）進(jìn)行圖像采集和定量分析。目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白（1:1 000，美國Sigma公司）的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Erbin 表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系采用Pearson′s Chi-Square 檢驗(yàn)?；颊呱娣治霾捎肒aplan-Meier 法，Log-Rank 檢驗(yàn)患者生存率的差別。2 個(gè)蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)。Cox 多因素風(fēng)險(xiǎn)比例模型用作評(píng)估影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Erbin蛋白和mRNA在ESCC組織中的表達(dá)

47例癌旁正常食管上皮的免疫組織化學(xué)染色顯示（圖1），Erbin的陽性信號(hào)主要位于鱗狀上皮的基底細(xì)胞，且定位在基底細(xì)胞的胞漿。在299 例ESCC 組織中（圖1），Erbin 的表達(dá)也定位在腫瘤細(xì)胞的胞漿，但陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度顯著增加，其陽性表達(dá)率為55.2%（165/299），明顯高于癌旁正常食管上皮的表達(dá)（0/47，P＜0.001）。此外，也檢測(cè)了40例非典型增生的食管上皮中Erbin的表達(dá)情況。低級(jí)別非典型增生病例的Erbin陽性表達(dá)率是0（0/18），而高級(jí)別非典型增生病例的Erbin 陽性表達(dá)率是31.8%（7/22）。高級(jí)別非典型增生病例的Erbin陽性表達(dá)率高于低級(jí)別增生（P＜0.001），但低于ESCC組織的表達(dá)率（P＜0.001）。

借助蛋白印跡和PCR 方法，在25 例配對(duì)的食管癌和癌旁正常食管組織中檢測(cè)了Erbin蛋白和基因的表達(dá)情況（圖1～3）。與正常食道上皮組織相比，ESCC 組織中Erbin 的蛋白和基因表達(dá)明顯增高（P＜0.05，圖4）。

選取60例ESCC組織并借助免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)δ-catenin蛋白的表達(dá)情況（圖5）。δ-catenin在ESCC組織中的陽性表達(dá)率為61.67%（37/60），且陽性信號(hào)位于腫瘤細(xì)胞的胞漿，顯著高于正常食管上皮的表達(dá)（0/47，P＜0.001）。Pearson相關(guān)分析顯示δ-catenin和Erbin的表達(dá)具有顯著正相關(guān)（r=0.626，P＜0.001，表1）。

圖1 Erbin在正常食管上皮和食管癌組織中的表達(dá)

?圖2 Erbin在正常食管上皮（N）和食管癌組織（T）中的基因（A）和蛋白（B）表達(dá)

?圖3 Erbin 在25 對(duì)正常食管上皮（N）和食管癌組織（T）中的蛋白表達(dá)

?圖4 Erbin 在25 對(duì)正常食管上皮（N）和食管癌組織（T）中的基因表達(dá)

圖5 δ-catenin在正常食管上皮和食管癌組織中的表達(dá)

表1 Erbin與δ-catenin在ESCC中表達(dá)的相關(guān)性

2.2 Erbin在ESCC組織中的高表達(dá)與患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的關(guān)系

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Erbin 在ESCC 組織中的表達(dá)顯著增高，其表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系見表2。Erbin 在Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達(dá)率為64.9%（87/134），高 于Ⅰ～Ⅱ期 的47.3%（78/165，P=0.002）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中Erbin的陽性表達(dá)率為65.5%（97/148），高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的45.0%（68/151，P＜0.001）。然而，Erbin的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分化程度或腫瘤浸潤深度均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 Erbin在ESCC組織中的陽性表達(dá)與患者的不良預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier 生存分析表明（圖4），134 例Erbin陰性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為（39.486±1.960）個(gè)月（95%CI=35.644～43.328），而165 例Erbin 陽性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間為（33.544±1.793）個(gè)月（95%CI=30.030～37.058），Erbin陽性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著短于陰性表達(dá)的患者（Log-Rank 檢驗(yàn)χ2=4.633，P=0.031）。

Cox多因素風(fēng)險(xiǎn)模型顯示（表3），Erbin的陽性表達(dá)不是ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（Risk=1.215，95%CI=0.867～1.705，P=0.258）。然而，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（Risk=2.032，95%CI=1.461～2.826，P＜0.001）、TNM 分 期（Risk=2.050，95% CI=1.481～2.836，P＜0.001）和腫瘤組織的分化程度（Risk=0.532，95%CI=0.322～0.878，P=0.014）均是判斷ESCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤浸潤深度和性別均不是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素（P=0.530，0.446，0.605，0.236）。值得注意的是，年齡也具有獨(dú)立的預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后的能力（Risk=1.422，95%CI=1.030～1.962，P=0.032）。

表2 ESCC中Erbin的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

圖4 299例ESCC患者根據(jù)Erbin表達(dá)狀態(tài)分類的Kaplan-Meier生存分析

表3 多變量Cox 回歸對(duì)299 例ESCC 患者的臨床病理參數(shù)的危險(xiǎn)度預(yù)測(cè)分析

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道Erbin在皮膚表皮的基底細(xì)胞層為胞漿彌漫染色，在表皮上部的細(xì)胞為胞膜染色，而在皮膚鱗癌組織中Erbin 的表達(dá)顯著增加，且既有胞漿表達(dá)，也有胞膜表達(dá)［13］。與皮膚中的表達(dá)模式不同，本研究顯示Erbin蛋白在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中呈微弱的胞漿表達(dá)，且陽性表達(dá)率為0（0/47），而在ESCC組織中表達(dá)顯著增加，其陽性表達(dá)率為55.2%（165/299）。本研究也發(fā)現(xiàn)食管鱗狀上皮高級(jí)別異型增生病例的Erbin陽性表達(dá)率高于低級(jí)別異型增生和正常鱗狀上皮的表達(dá)（P＜0.001），但低于鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)（P＜0.001），說明Erbin的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的侵襲進(jìn)展。此外，Erbin 的表達(dá)與食管癌pTNM 分期（P=0.002）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（P＜0.001）呈正相關(guān)，說明Erbin 不但促進(jìn)食管癌患者的臨床進(jìn)展，而且也參與了腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另外，與癌旁正常食管組織相比，本研究顯示Erbin蛋白和基因表達(dá)水平在ESCC組織中均明顯增高，這與免疫組織化學(xué)中的結(jié)果相一致，證明Erbin 蛋白表達(dá)增多主要是由于其基因轉(zhuǎn)錄增加所導(dǎo)致的，與在肝細(xì)胞肝癌［7］、乳腺癌［8］、結(jié)直腸癌組織［14］中的研究結(jié)果一致，而且其表達(dá)與腫瘤TNM 分期呈正相關(guān)，這與本研究在食管癌中得到的結(jié)果是一致的。上述研究結(jié)果均說明Erbin在惡性腫瘤的演進(jìn)中可能扮演重要的促癌角色。然而，是在結(jié)直腸癌組織中進(jìn)行研究，另一篇報(bào)道顯示Erbin 的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯減少［15］，并且Erbin 通過抑制ERK 和Akt 信號(hào)通路的活性而發(fā)揮抑癌作用。在同樣的腫瘤中Erbin的表達(dá)模式完全相反的情況需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究顯示Erbin 陽性表達(dá)的ESCC患者的生存時(shí)間明顯短于陰性表達(dá)的患者（P=0.031），提示Erbin 在食管癌的進(jìn)展中扮演了促癌角色。然而，多因素風(fēng)險(xiǎn)模型顯示Erbin 的表達(dá)并不是判斷食管癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.258），而腫瘤的分化程度、pTNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是ESCC患者獨(dú)立的預(yù)后因素。值得注意的是，年齡也是食管癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素（P=0.032），推測(cè)可能隨著年齡的增加食管鱗狀上皮發(fā)生非典型增生的幾率增高，進(jìn)而發(fā)展到鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生概率也明顯高于年齡較低的人群。

同樣是在乳腺癌組織中進(jìn)行的研究，有報(bào)道稱Erbin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著減少［12］，并且Erbin通過抑制Akt信號(hào)通路的活性而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，該結(jié)果顯示Erbin 具有抑癌蛋白的作用，這與上文在乳腺癌中的研究結(jié)果正好相反［8］。推測(cè)Erbin在相同的腫瘤中出現(xiàn)相反的表達(dá)可能與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量有關(guān)。前者用做免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的乳腺癌組織標(biāo)本僅為20 例，而后者用作免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的乳腺癌標(biāo)本多達(dá)171 例，因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量去驗(yàn)證Erbin在乳腺癌組織中的確切表達(dá)情況。本研究選取了較大樣本的ESCC 組織進(jìn)行檢測(cè)，得出Erbin 在腫瘤組織中表達(dá)增加的結(jié)論進(jìn)一步明確了其作為促癌蛋白在參與食管癌侵襲進(jìn)展過程中扮演的重要角色。當(dāng)然，Erbin 可能在不同的腫瘤甚至相同的腫瘤中扮演截然相反的角色，但這不排除可能與腫瘤細(xì)胞的類型以及Erbin 在腫瘤細(xì)胞中的定位有關(guān)，特別是Erbin在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)的定位與其在腫瘤演進(jìn)中扮演的“雙重身份”可能密切相關(guān)，需要深入研究。

Erbin 與δ-catenin 同屬黏附連接蛋白，且兩者可以直接結(jié)合而參與上皮細(xì)胞的連接和上皮極性的維持。既往研究已經(jīng)闡釋了δ-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平在食管癌［11］、肺癌［16］組織中顯著增加，而且δ-catenin 的陽性表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此在本研究中，Erbin 與δ-catenin 在腫瘤演進(jìn)過程中所扮演的促癌角色是一致的，且兩者在ESCC組織中的表達(dá)顯著正相關(guān)（r=0.626，P＜0.001），說明兩個(gè)蛋白具備功能上的結(jié)合效應(yīng)。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)而在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在食管癌中Erbin是否通過增強(qiáng)MMPs的活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，需要借助食管癌細(xì)胞系開展深入研究。

綜上所述，本研究揭示了Erbin的表達(dá)在ESCC組織中明顯增加，且Erbin的陽性表達(dá)與食管癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，這對(duì)將來開發(fā)針對(duì)Erbin的腫瘤靶向藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，而明確Erbin促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制是本課題組下一步的研究方向。