無瓣海桑果實(shí)提取物對D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力的影響＊

李家怡，易湘茜,2,3＊＊，杜正彩，高程海，郝二偉,3，鄧家剛,3

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530020；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510632；3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物研究所 南寧 530023）

無瓣海桑（Sonneratiaapetala）為海?？坪Ｉ賳棠荆瑥V泛分布在我國海南島、廣西、廣東、福建和臺灣等省[1]。無瓣海桑果實(shí)可食用，其產(chǎn)量大，含有大量的氨基酸、總酚、花青素等[2-4]。研究組對無瓣海桑果實(shí)醇提物和不同極性提取物研究發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)的體外清除自由基能力[5]?？顾ダ吓c自由基的清除具有密切關(guān)系，體內(nèi)的自由基大量積累會最終導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞的衰老與死亡。目前還未見無瓣海桑果實(shí)的體內(nèi)抗衰老作用研究，本研究旨在探討無瓣海桑果實(shí)醇提物和各極性提取物的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性昆明小鼠108 只，體重18-22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK 桂2014-0002。常規(guī)飼養(yǎng)在動物房內(nèi)，溫度為23℃，濕度為45-55%，自然光線下養(yǎng)殖，晝夜比為1∶1，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2 無瓣海桑果實(shí)醇提物及不同極性提取物制備

同文獻(xiàn)[5]，摘取新鮮成熟的無瓣海桑果實(shí)，用95%乙醇浸泡減壓濃縮后得到乙醇提取物（EE），并依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取得到乙酸乙酯提取物（EAE）和正丁醇提取物（BE），減壓濃縮，真空冷凍干燥后備用。

1.3 主要試劑

D-半乳糖和水溶性維生素E（95%）由索萊寶公司提供（批號分別為D8310、ST9160）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒由南京建成生物工程公司所提供（批號分別為20170214、20170220、20170213）。

1.4 主要儀器

Infinite 200 酶標(biāo)儀（奧地利TECAN 公司），ST16R臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Thermo公司），HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），Carry 100紫外分光光度計（美國瓦里安公司），DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

圖1 各組小鼠血清中SOD、GSH-Px、MDA測定結(jié)果

1.5 動物分組、衰老模型建立及給藥

小鼠適應(yīng)環(huán)境3-5 天后，將其按體重隨機(jī)分成空白組、模型組、陽性組（水溶性維生素E，VE100 mg·kg-1）、無瓣海桑果實(shí)乙醇提取物高劑量組（EE-H 組）、低劑量組（EE-L 組）結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定濃度分別為250 mg.kg-1、125 mg.kg-1；按照萃取過程中各自的得率，換算為和乙醇提取物高、低劑量對應(yīng)同等劑量，無瓣海桑果實(shí)乙酸乙酯提取物高劑量組（EAE-H組）、低劑量組（EAE-L 組）濃度分別為76 mg.kg-1、38 mg.kg-1，無瓣海桑果實(shí)正丁醇提取物高劑量組（BE-H 組）、低劑量組（BE-L組）濃度分別為19 mg.kg-1、9.5 mg.kg-1，每組各12只小鼠。除空白組外，其余各組小鼠每日皮下注射120 mg.kg-1D-半乳糖溶液，連續(xù)注射13周誘導(dǎo)建立衰老小鼠模型，空白組注射等量生理鹽水。第8 周開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥42 天，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，灌胃體積統(tǒng)一為20 mL.kg-1，藥物全部用蒸餾水溶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日摘眼球取血，脫臼處死小鼠，采集實(shí)驗(yàn)樣本，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.6 血清中SOD、GSH-Px、MDA的測定

小鼠眼球摘除取血，常溫靜置1.5 h后，3 500 r.min-1離心10 min，分離得到血清。參照試劑盒中測定說明書的方法和步驟對血清進(jìn)行測定SOD、GSH-Px 和MDA。

1.7 肝臟和心臟中SOD、GSH-Px、MDA的測定

脫臼處死小鼠，低溫條件下取出其心臟和肝臟，用生理鹽水洗去多余的血液，濾紙吸干后稱重，分別用勻漿器勻漿，用生理鹽水稀釋成10%肝臟勻漿和心臟勻漿，4 000 r.min-1離心15 min，取上清液參照試劑盒中說明書要求測定肝臟和心臟中SOD、GSH-Px和MDA水平。

1.8 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行分析。使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)，P ＜0.05時表示具有統(tǒng)計學(xué)差異，數(shù)據(jù)表示為（xˉ±s）。

2 結(jié)果

2.1 無瓣海桑果實(shí)提取物對衰老小鼠血清SOD、GSHPx、MDA的影響

結(jié)果如圖1所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中的SOD、GSH-Px 酶活力顯著下降（P ＜0.01），MDA含量顯著增加（P ＜0.01），表明衰老模型建立成功，模型組小鼠抗氧化能力下降。與模型組相比，陽性組小鼠血清中SOD、GSH-Px 酶活力顯著增加（P ＜0.01），MDA含量顯著降低（P ＜0.01），表明VE能有效提高衰老小鼠抗氧化能力，與前人研究一致[6]。與模型組相比，EE-H組和EE-L組小鼠血清中SOD、GSH-Px活力均顯著增加（P ＜0.01），MDA 的含量顯著減少（P ＜0.01），無瓣海桑果實(shí)醇提物能有效提高衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化酶活力，減少脂質(zhì)過氧化。與模型組相比，EAE-H 組和EAE-L 組小鼠血清中SOD、GSH-Px 酶活力顯著提高（P ＜0.01），MDA 含量顯著降低（P ＜0.01），表明無瓣海桑果實(shí)乙酸乙酯提取物能有效改善因衰老造成的抗氧化酶活力下降和脂質(zhì)過氧化含量增加。與模型組相比，BE-H 組和BE-L 組小鼠血清中SOD 活力均具有差異性（P ＜0.05）。BE-H 組和BE-L組小鼠血清中的GSH-Px 酶活力與MDA 含量均具有顯著性差異（P ＜0.01），表明無瓣海桑果實(shí)正丁醇提取物能有效提高衰老模型小鼠血清中SOD、GSH-Px酶活力，減少M(fèi)DA的含量。

2.2 無瓣海桑果實(shí)提取物對衰老小鼠心臟SOD、GSHPx、MDA的影響

結(jié)果如圖2所示，與空白組相比，模型組小鼠心臟中SOD、GSH-PX 活力顯著降低（P ＜0.01），體內(nèi)清除自由基能力下降，MDA含量顯著提高（P ＜0.01），表明衰老模型建立成功。與模型組相比，EE-H組和EE-L組小鼠心臟中SOD 活力顯著上升（P ＜0.01），MDA 含量顯著下降（P ＜0.01），無瓣海桑果實(shí)醇提物能有效提高衰老小鼠心臟中抗氧化能力，高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。與模型組相比，EAE-L 組小鼠心臟中SOD、GSH-Px 酶活力顯著增加（P ＜0.01）。EAE-H 組和EAE-L 組小鼠心臟中MDA 含量顯著性下降（P ＜0.01），其中EAE-L組效果與空白組接近。與模型組相比，BE-H 組小鼠心臟中SOD 酶活力顯著增加（P ＜0.01），MDA含量顯著下降（P ＜0.01），效果與給藥濃度呈一定的量效關(guān)系。

2.3 無瓣海桑果實(shí)提取物對衰老小鼠肝臟SOD、GSHPx、MDA的影響

結(jié)果如圖3所示，與空白組相比，模型組肝臟中的SOD、GSH-Px酶活力顯著降低（P ＜0.01），肝臟抗氧化酶活力降低，MDA的含量增加并具有差異（P ＜0.05），表明衰老模型建立成功。與模型組相比，EE-H 組和EE-L 組小鼠肝臟中SOD 酶活力顯著增加（P ＜0.01），EE-H 組小鼠肝臟中MDA 含量降低，并具有差異性（P ＜0.05），表明無瓣海桑果實(shí)醇提物能提高衰老小鼠肝臟的抗氧化酶活力，減少脂質(zhì)過氧化，高劑量效果優(yōu)于低劑量組效果。與模型組相比，EAE-L組小鼠肝臟中MDA 含量顯著降低（P ＜0.01），EAE-H 組小鼠肝臟中GSH-Px 酶活力顯著增加（P ＜0.01），表明無瓣海桑果實(shí)乙酸乙酯提取物能在一定劑量上增加衰老小鼠肝臟的抗氧化酶活力，并減少有害物質(zhì)在肝臟的積累。與模型組相比，BE-L 組小鼠肝臟SOD酶活力和GSHPx 酶活力具有差異性（P ＜0.01，P ＜0.05），MDA 含量降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），表明無瓣海桑果實(shí)正丁醇提取物能有效改善由于衰老引起的SOD、GSHPx 酶活力下降和MDA 大量積累。其中BE-L 組效果接近空白組效果。

圖2 各組小鼠心臟中SOD、GSH-Px、MDA測定結(jié)果

3 總結(jié)與討論

自由基與衰老密切相關(guān)，活性氧的增多，會導(dǎo)致體內(nèi)自由基失衡，促進(jìn)機(jī)體體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，對細(xì)胞產(chǎn)生損傷[7]。超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶，其活力的高低可間接反映機(jī)體消除自由基的能力大小[8]。丙二醛（MDA）是衡量機(jī)體自由基代謝的敏感指標(biāo)，其含量能客觀地反映機(jī)體產(chǎn)生自由基的水平[9]。許多研究結(jié)果表明，衰老小鼠或大鼠體內(nèi)過量產(chǎn)生的自由基造成氧自由基代謝失衡，各項(xiàng)細(xì)胞功能紊亂，SOD 活力和GSH-PX活力明顯下降，MDA含量明顯上升，是機(jī)體已經(jīng)衰老的表現(xiàn)[10]。所以測定SOD、GSH-Px 和MDA 有助于了解機(jī)體的衰老情況。

實(shí)驗(yàn)中采用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三種極性溶劑對乙醇提取物進(jìn)行萃取。氯仿極性最小，獲得的氯仿萃取物成分都是小極性油類成分。前期用體外細(xì)胞學(xué)定量分析方法（CAA法）測試了各萃取物的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯仿萃取物及殘余水相沒有顯示出活性。另外，如果只用氯仿和正丁醇來做乙醇提取物的萃取溶劑，雖能分別獲得小極性分子萃取部分和大極性分子萃取部分，但會造成中大極性成分都集中在正丁醇層，特別是該萃取部分又顯示出良好的活性，較難區(qū)分究竟是中極性分子部分還是大極性分子部分的活性更強(qiáng)。因此，選擇兩者分子有部分交叉的乙酸乙酯和正丁醇相作為活性測試部位更適合。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠的SOD、GSH-Px 活力均顯著性下降，MDA 含量顯著增加，表明使用D-半乳糖連續(xù)注射小鼠可造成小鼠衰老，致衰老模型建模成功。而陽性藥物維生素E 作為具有顯著抗氧化效果并被廣泛使用的抗衰老藥物，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比均具有差異性，表明維生素E 具有良好的抗衰老效果，與前人研究結(jié)果相同。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無瓣海桑果實(shí)醇提物具有提高衰老小鼠體內(nèi)SOD、GSH-Px酶活力，降低MDA含量的作用，效果與濃度具有一定的量效關(guān)系。無瓣海桑果實(shí)醇提物的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均能有效改善衰老小鼠體內(nèi)抗氧化水平。其中BE-L組能有效提高衰老小鼠血清、肝臟中SOD、GSH-Px酶活力，降低MDA含量，且效果接近空白組。

綜上所述，無瓣海桑果實(shí)醇提物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均具有一定的抗衰老作用，通過增加SOD、GSH-Px酶活力和降低MDA 的含量，清除機(jī)體內(nèi)過量的自由基，達(dá)到抗衰老的目的。其中，無瓣海桑果實(shí)正丁醇提取物組抗氧化效果與空白組接近，推測其是無瓣海桑果實(shí)延緩衰老、改善記憶的主要活性部位。