桂枝茯苓膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)作用及機(jī)制＊

孫 蘭，李家春，宗紹波，呂耀中，王振中＊＊

（1.江蘇省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 淮安 223003；2.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 淮安 223003；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；4.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）是育齡期女性的常見(jiàn)疾病，主要表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺體在子宮腔以外的部位生長(zhǎng)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)不調(diào)、盆腔包塊等，其發(fā)病率約占育齡期婦女的15%左右[1]。痛經(jīng)是子宮內(nèi)膜異位癥患者的主要癥狀，據(jù)統(tǒng)計(jì)EM 患者87.7%有痛經(jīng)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確[2]。有研究表明瞬時(shí)受體電位辣椒素亞型l(Transient Receptor Potential Vanilloid Receptor 1，TRPV1)與子宮內(nèi)膜異位癥疼痛相關(guān)，子宮內(nèi)膜異位組織TRPV1 蛋白表達(dá)顯著升高[3]。TRPVl受到多種炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、緩激肽(bradykinin，BK)、前列腺素(prostaglandin，PG)[4]等。

桂枝茯苓丸出自東漢著名醫(yī)學(xué)家張仲景的《金匱要略》，在臨床使用了近兩千年，其處方由五味藥材組成，即桂枝、牡丹皮、茯苓、桃仁、芍藥。以桂枝茯苓丸為基礎(chǔ)，通過(guò)工藝改進(jìn)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研制成現(xiàn)代中藥制劑桂枝茯苓膠囊，桂枝茯苓膠囊具有活血、化瘀、消癥等功效，臨床上用其治療痛經(jīng)、子宮肌瘤、盆腔炎性后遺癥、子宮內(nèi)膜異位癥等婦科血瘀性疾病具有確切療效。研究表明桂枝茯苓膠囊對(duì)子宮本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制大鼠子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)模型[5,6]，探討桂枝茯苓膠囊治療子宮內(nèi)膜異位癥疼痛機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

桂枝茯苓膠囊，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：1700425，規(guī)格：0.31 g·粒-1；散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.4 g·粒-1，批號(hào)：170216；苯甲酸雌二醇注射液，寧波第二激素廠，批號(hào)：20170212，規(guī)格：2 mL：4 mg；縮宮素注射液，寧波第二激素廠，規(guī)格：2 mL：20 IU，批號(hào)：170118；Anti-NGF 抗體，Abcam，ab52918；Anti-VR1 抗體，Abcam，ab74855；MaxVision TM 免疫組化檢測(cè)試劑盒，福建邁新生物技術(shù)有限公司；PBS 緩沖液：自行配制，每升中含8 g Na-Cl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH 調(diào)至7.4。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雌性，180-200 g，雌性，由維通利華提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0003。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，飼養(yǎng)室溫度20-25℃，相對(duì)濕度為40-65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺，德國(guó)美耐特；DX45奧林帕斯顯微鏡，日本生產(chǎn)；櫻花全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)；Thermo 包埋機(jī)，型號(hào)Histostar；Thermo 手動(dòng)切片機(jī)，型號(hào)：Finesse E+；Shandon全自動(dòng)染色機(jī)；OLYMPUS顯微鏡BX41。

2 方法

2.1 分組、模型復(fù)制及給藥

80只SD大鼠，隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組，其余70 只大鼠用于子宮內(nèi)膜異位癥模型復(fù)制。大鼠稱(chēng)重后，10%水合氯醛3.5 mL·kg-1，腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，用一次性備皮刀逆被毛方向剃毛，仰臥位固定，絡(luò)合碘常規(guī)消毒皮膚后，鋪巾于下腹正中靠左上方做長(zhǎng)1 cm 切口，進(jìn)腹后在膀膚背側(cè)找到子宮，挑出左側(cè)子宮角，近端離左子宮角1 cm 處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢1 cm處結(jié)扎并切下左側(cè)部分子宮，將切下的子宮組織放在盛有PBS液體的培養(yǎng)皿中，縱行解剖開(kāi)子宮段，剪取5 mm×5 mm 的子宮內(nèi)膜組織（含子宮肌層）一塊。取子宮內(nèi)膜組織一塊，內(nèi)膜面貼于種植部位用6-0 絲線對(duì)角縫合固定于右側(cè)前腹壁內(nèi)側(cè)腹膜，絡(luò)合碘稀釋液沖洗盆腔，4-0 絲線常規(guī)縫合關(guān)腹。術(shù)后注意保暖。麻醉蘇醒后正常喂養(yǎng)。假手術(shù)組：手術(shù)步驟同實(shí)驗(yàn)組，僅切去部分子宮后，不植入子宮內(nèi)膜，替代以6-0絲線在右側(cè)前腹壁內(nèi)側(cè)腹膜上縫合2針。手術(shù)后，連續(xù)注射青霉素3天，40萬(wàn)單位·每鼠-1。術(shù)后2天，大鼠每4天皮下注射雌二醇0.1 mg·kg-1·天-1，總共三次，可以促進(jìn)增長(zhǎng)異位子宮內(nèi)膜。

28天恢復(fù)期后，70只子宮內(nèi)膜異位癥大鼠麻醉開(kāi)腹觀察紅色/棕色顏色和囊性植入物表面形成，這是模型成功標(biāo)志。測(cè)量植入子宮內(nèi)膜的體積，以確保所有的大鼠表現(xiàn)出類(lèi)似的異位病灶的大小。選擇50只，分為模型組、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組（0.47 g·kg-1）、桂枝茯苓膠囊三個(gè)劑量組（0.54 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.14 g·kg-1）。各組灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積0.5%CMC-Na 混懸液，給藥體積10 mL·kg-1。連續(xù)4 周，每天1次。給藥第4周，假手術(shù)組大鼠背部皮下注射生理鹽水，其余組動(dòng)物注射雌激素0.05 mL·0.1 mg-1·只-1，連續(xù)7天。末次灌胃1 h后，各鼠腹部注射縮宮素注射液1.0 mL·10 IU-1·只-1。觀察大鼠并記錄30 min 內(nèi)大鼠扭體次數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算扭體次數(shù)抑制率（%）（抑制率%=（模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)/模型組扭體次數(shù)）×100%）。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 異位組織體積

扭體觀察結(jié)束后，10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)腹腔麻醉，逐層打開(kāi)腹腔，觀察異位灶形態(tài)并用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物長(zhǎng)、寬、高（mm），計(jì)算異位組織體積(異位組織體積=0.52×長(zhǎng)×寬×高，mm3)。

2.2.2 異位組織病理觀察

測(cè)量體積后，迅速取出大鼠異位灶組織，立即置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE 染色，鏡下觀察異位灶的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。病理專(zhuān)業(yè)人員閱片，根據(jù)病變輕重程度，依次半定量為輕度：“+”，中度“++”，重度“+++”，無(wú)病變組織標(biāo)記為“-”。

2.2.3 免疫組化法檢測(cè)NGF、TRPV1蛋白表達(dá)

異位灶組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。

PBS 洗3 次，每遍5 min。用PBS 配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水洗1次；抗原修復(fù)，PBS洗5 min，甩去多余液體滴加一抗4℃過(guò)夜（NGF稀釋度為1∶250；TRPV1 稀釋度為1∶1000，過(guò)夜后在37℃復(fù)溫45 min），PBS洗3次各5 min，甩去PBS液，每張切片加1滴50 μl MaxVision TM試劑，室溫下孵育15 min，PBS洗3次各5 min，每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1 min，陽(yáng)性顯色為棕色，蒸餾水洗終止染色，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗返藍(lán)，采用不同濃度酒精脫水，最后透明及封片，每張切片觀察5 個(gè)高倍視野，用分析軟件（Image Pro Plus 5.0.2）測(cè)定光密度值。

2.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理

采用Graphpad Prism5.0（GPW5-384305-RAG-5235）軟件處理數(shù)據(jù)，以均數(shù)±方差（±SD）表示結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 GZFLC 對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠疼痛反應(yīng)的影響

結(jié)果表明，與模型組相比，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組大鼠扭體次數(shù)明顯減少（P ＜0.01），其抑制率為51.1%，GZFLC 三個(gè)劑量組均能顯著減少大鼠扭體次數(shù)（P ＜0.01），其抑制率分別為63.2%、60.4%、47.1%（表1）。

3.2 GZFLC對(duì)大鼠移植物體積的影響

與模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組和GZFLC 高、中、低劑量組大鼠移植物體積顯著減少（P ＜0.01），其抑制率分別為61.9%、66.0%、59.1%、56.6%。（表2）

3.3 GZFLC對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織病理的影響

結(jié)果表明，模型組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞明顯增生，腺體數(shù)量減少，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管明顯增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組異位的子宮內(nèi)膜呈萎縮性改變，腺體腺腔變小，甚至呈縫隙狀，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管輕度增生，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P ＜0.05）；桂枝茯苓膠囊各劑量組異位的子宮內(nèi)膜呈萎縮性改變，腺體腺腔變小，甚至呈縫隙狀，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管增生減輕，與模型組比較有明顯改善作用（P ＜0.05）（表3，圖1）。

3.4 GZFLC 對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織NGF、TRPV1表達(dá)的影響

結(jié)果表明，模型組棕黃色面増多，提示NGF、TRPV1 表達(dá)明顯，與模型組比較，GZFLC 高、中、低劑量組棕黃色區(qū)域減少，GZFLC 顯著降低大鼠子宮內(nèi)膜異位組織NGF、TRPV1蛋白表達(dá)（P ＜0.01，P ＜0.05）（表4，圖2，3）。

4 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡婦女的多發(fā)病，近年發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，子宮內(nèi)膜異位癥的臨床表現(xiàn)包括疼痛、不育和盆腔包塊、其中疼痛是最困擾患者的癥狀[7]，約70%-80%患者有不同程度的疼痛，包括痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛和大便痛，嚴(yán)重影響患者的身心健康，痛經(jīng)是困擾內(nèi)異癥患者主要原因之一，緩解痛經(jīng)是臨床治療內(nèi)異癥的主要目的之一[8]。子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，高水平雌激素不僅能促使子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)，還能引起一系列內(nèi)環(huán)境紊亂從而引起痛經(jīng)[9]，其機(jī)制可能是增高的雌激素刺激前列腺素的產(chǎn)生參與內(nèi)異癥疼痛的發(fā)生[10]。目前自體移植法是復(fù)制子宮內(nèi)膜異位癥模型常用方法[11,12]，在自體移植手術(shù)的基礎(chǔ)上，采用雌激素及縮宮素誘導(dǎo)痛經(jīng)模型是研究子宮內(nèi)膜異位癥疼痛發(fā)病機(jī)制的常用方法[5,6]。

表1 GZFLC對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠疼痛反應(yīng)的影響（Xˉ±SD,n=10）

表2 GZFLC對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)大鼠移植物體積的影響（Xˉ±SD,n=6）

表3 GZFLC對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織病理評(píng)分的影響（Xˉ±SD,n=6）

表4 GZFLC對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織NGF、TRPV1蛋白表達(dá)的影響（Xˉ±SD,n=3）

圖1 GZFLC對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織病理評(píng)分的影響(HE，×200)

圖2 GZFLC對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織TRPV1蛋白表達(dá)的影響(SP，×200)

圖3 GZFLC對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)大鼠子宮內(nèi)膜異位組織TRPV1蛋白表達(dá)的影響(IHC，×200)

TRPV1主要分布于傷害性感覺(jué)神經(jīng)元，TRPV1通道被激活后能使感覺(jué)神經(jīng)末梢痛覺(jué)敏感性增加，同時(shí)對(duì)疼痛的持續(xù)存在產(chǎn)生作用[13]。研究結(jié)果顯示TRPV1在外周神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織均有表達(dá)，如膀胱、胃腸道、平滑肌細(xì)胞等[14-16]。通道在炎性和神經(jīng)病理性狀態(tài)下有著非常重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)某些內(nèi)臟疼痛的疾病TRPV1 表達(dá)增多，如腸易激綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥等[17,18]。TRPV1在介導(dǎo)炎性痛、神經(jīng)性疼痛及內(nèi)臟痛等疾病受到致敏因子NGF、BK、PG 等的調(diào)節(jié)[4]。疼痛必須通過(guò)神經(jīng)來(lái)感知，研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位病灶均有NGF的高表達(dá)，且與患者疼痛癥狀的嚴(yán)重程度有關(guān)[19]。研究表明NGF 能夠增加TRPV1 的表達(dá)[20]。

GZFLC 方中桂枝味辛甘而性溫，入氣入血以溫通經(jīng)脈而行瘀滯，桃仁為化瘀消癥之要藥，牡丹皮能散血行瘀，白芍有活血養(yǎng)血止痛功效，茯苓甘淡，消痰利水，滲濕健脾，以助消癥之力。本研究結(jié)果表明，GZFLC能明顯抑制子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)，并能顯著減小子宮內(nèi)膜異位組織體積，GZFLC 治療后使異位的子宮內(nèi)膜呈萎縮性改變，對(duì)NGF、TRPV1 的蛋白表達(dá)均有抑制作用。提示GZFLC 可能通過(guò)抑制TRPV1及NGF的表達(dá)，從而緩解子宮內(nèi)膜異位癥疼痛的發(fā)生。