賴氨酸特異性的去甲基化酶3A對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

柳小佩 張博方 陳靜

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

賴氨酸特異性的去甲基化酶3A[lysine(k)-specific demethylase 3A，KDM3A]是一種鐵和草酸根依賴的雙加氧酶，可特異性催化H3K9me1/2的去甲基化，具有表觀遺傳學(xué)特性[1]。前期研究證實(shí)，KDM3A在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用，可通過調(diào)控心肌炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子的基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9m2甲基化程度，調(diào)節(jié)相應(yīng)關(guān)鍵因子表達(dá)，從而改變心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等的多種功能[2-3]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在心血管疾病中的再生血管潛力已獲廣泛研究。EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的主要來源，通過恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和參與新生血管形成來修復(fù)血管損傷，同時(shí)也可通過旁分泌釋放多種親血管生成的分子來修復(fù)受損血管[4]。而KDM3A作為一種去甲基化酶，雖然調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，但其調(diào)節(jié)EPCs的作用目前尚無充分研究結(jié)果。筆者推測(cè)，KDM3A可能參與調(diào)節(jié)EPCs的增殖、遷移及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮修復(fù)受損血管的功能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(日本Dojindo Laboratories公司)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(endothelial cell growth medium-2，EGM-2)(Lonza)，胎牛血清(Gibco)，一抗：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(Abcam)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(武漢三鷹)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)(Abcam)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(protein kinase B，PI3K/Akt)和p-Akt(CST)。二抗：HRP-Goat Anti Rabbit(ASPEN)。酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，熒光倒置顯微鏡(Nikon)，Transwell小室(美國Corning公司)。

1.2 原代EPCs的分離與培養(yǎng)

用淋巴細(xì)胞分離液通過梯度離心法從同基因型成年雄性SD大鼠(體重150～180 g)的后肢長(zhǎng)骨中分離出骨髓單核細(xì)胞(marrow mononuclear cells，MNCs)。隨后，使用ECM-2分離并重懸于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再加入20%血清、1%青霉素/鏈霉素，混勻，培養(yǎng)于37℃、95%空氣、5%CO2的環(huán)境下。3 d后，待細(xì)胞形成集落，棄去培養(yǎng)基中的未貼壁細(xì)胞，再加入新配制的含有20%血清、1%青霉素/鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 d。7 d后，光鏡下觀察EPCs細(xì)胞呈紡錘形，聚集率達(dá)80%左右。將細(xì)胞用胰蛋白酶?jìng)鞔囵B(yǎng)3周后即出現(xiàn)典型的鵝卵石樣原代EPCs。

1.3 原代EPCs的鑒定與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

熒光標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白[1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine (DiI)-labeled acetylated low density lipoprotein，Dil-acLDL]與FITC-UEA-1[the fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled Ulex europaeus agglutinin (UEA)-1]結(jié)合共染實(shí)驗(yàn)對(duì)EPCs進(jìn)行鑒定[5]。將培養(yǎng)好的EPCs用PBS浸洗后加入Dil-acLDL(10 μg/ml)，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4 h。4 h后再加入FITC-UEA-1(10 μg/ml)，繼續(xù)孵育1 h。孵育結(jié)束后，細(xì)胞進(jìn)行4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，在熒光顯微鏡下觀察被Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙染的EPCs的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)采用3～5代的EPCs，按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法分為3組：(1)空白組(Con)：EPCs培養(yǎng)3周后作為空白對(duì)照；(2)Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組(Ad-GFP)：使用空白腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs，作為病毒對(duì)照；(3)Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組(Ad-KDM3A)：使用含有KDM3A特異性腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs。

1.4 腺病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

編碼KDM3A的腺病毒載體(Ad-KDM3A)和對(duì)照所需的綠熒光蛋白(Ad-GFP)的腺病毒載體由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)和提供。本課題組既往研究顯示MOI值為50時(shí)，腺病毒轉(zhuǎn)染效率最佳[6]。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)皿的40%～50%時(shí)，根據(jù)最適MOI值轉(zhuǎn)染相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，棄去含有腺病毒的無血清培養(yǎng)基，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.5 細(xì)胞增殖的檢測(cè)

用CCK-8試劑盒檢測(cè)EPCs增殖能力。將各組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，重懸接種入96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。調(diào)整每孔的細(xì)胞數(shù)量為4×103個(gè)，每孔加入200 μl的EGM-2培養(yǎng)基后孵育24 h。孵育結(jié)束后每孔加入20 μl CCK-8試劑并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)時(shí)各組的A值。

1.6 細(xì)胞遷移的檢測(cè)

使用24孔、8 μm孔徑的Transwell小室檢測(cè)EPCs遷移能力。將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，調(diào)整每組細(xì)胞數(shù)量為105，用5%血清的EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后加入上室，在下室中加入20%血清的EGM-2。放入培養(yǎng)箱孵育12 h后，遷移的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色。在200倍顯微鏡下至少隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目。

1.7 細(xì)胞體外血管形成的檢測(cè)

在96孔板的每孔中加入80 μl的基質(zhì)膠，待1 h后基質(zhì)膠凝固，將每組的EPCs數(shù)量調(diào)整為1×104，重懸于100 μl EGM-2培養(yǎng)基中，分別接種至已凝固的基質(zhì)膠孔中。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察小管的結(jié)構(gòu)并計(jì)算新生管腔數(shù)量。

1.8 細(xì)胞分泌能力及相關(guān)機(jī)制檢測(cè)

用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)3組新生血管相關(guān)細(xì)胞因子VEGF、SDF-1和調(diào)控機(jī)制相關(guān)的Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染效率干擾siRNA對(duì)KDM3A蛋白的下調(diào)作用

熒光顯微鏡下觀察腺病毒的轉(zhuǎn)染效率，腺病毒轉(zhuǎn)染過的EPCs發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光(圖1A)，本實(shí)驗(yàn)腺病毒在MOI=50時(shí)的轉(zhuǎn)染效率接近90%。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組的KDM3A蛋白表達(dá)水平明顯高于Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組(P<0.05)，見圖1B。

A：腺病毒轉(zhuǎn)染過的EPCs發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光(×40)；B：腺病毒siRNA顯著下調(diào)EPCs中KDM3A蛋白的表達(dá)，與空白組比較，aP<0.05圖1 腺病毒的轉(zhuǎn)染效率(n=3)

2.2 下調(diào)KDM3A的表達(dá)對(duì)EPCs的增殖能力的影響

相對(duì)于空白組，Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組的EPCs在450 nm的A值比為1.031±0.059，空白組和Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組組間比較無明顯差異。而Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組的EPCs的A值比為1.393±0.058，較Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯增高(P=0.0016)。表明下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)EPCs的增殖能力。

2.3 下調(diào)KDM3A的表達(dá)對(duì)EPCs的遷移能力的影響

相對(duì)于空白組，Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組的EPCs遷移數(shù)量比值為1.21±0.11，空白組和Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組組間比較無明顯差異。而Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組遷移至下室的EPCs數(shù)量比值為1.89±0.12，較Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯增多(P=0.0023)(圖2)。表明下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)EPCs的遷移能力。

2.4 下調(diào)KDM3A的表達(dá)對(duì)EPCs體外血管形成能力的影響

相對(duì)于空白組，Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組的新生血管管腔數(shù)量比為1.027±0.038，空白組和Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組組間比較無明顯差異。而Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組為1.552±0.109，較Ad-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯增多(P=0.0103)(圖3)。表明Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組的體外血管形成能力更強(qiáng)，基本形成了完整的管腔。因此，下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)EPCs體外血管形成能力。

2.5 下調(diào)KDM3A的表達(dá)對(duì)EPCs分泌促血管生成因子能力的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比空白組，Ad-KDM3A轉(zhuǎn)染處理組明顯促進(jìn)EPCs分泌VEGF和SDF-1(均為P<0.05)，表明下調(diào)KDM3A的表達(dá)可以提高EPCs分泌促血管生成因子的能力。同時(shí)，還伴隨著p-Akt/Akt蛋白表達(dá)的升高，提示KDM3A對(duì)VEGF、SDF-1分泌的調(diào)節(jié)可能是通過Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用的(圖4)。

3 討論

冠心病作為最常見的心血管疾病，即使急性心肌梗死的患者在第一時(shí)間接受了冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療，還是會(huì)有部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)，心肌再次缺血壞死甚至心力衰竭[7]。而改善心肌缺血的其中一種方法就是促進(jìn)新生血管的形成來代償心肌缺血造成的組織損傷[4]。在此過程中，心肌缺血損傷后，EPCs被認(rèn)為是血管的“再生原料”遷移至缺血部位，通過形成毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)成分和分泌血管生成因子來促進(jìn)血管再生。而且EPCs也能分化為心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)血管和心肌的修復(fù)，從而維持心肌梗死后的心功能[8-9]。因此，調(diào)控EPCs的生長(zhǎng)和活性可能會(huì)緩解心肌缺血導(dǎo)致的一系列心血管疾病，如心絞痛、心肌梗死等，也可能改善心肌梗死患者預(yù)后。

KDM3A作為一種去甲基化酶，早期被證實(shí)可加重不同腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及血管形成，其失調(diào)表達(dá)與多種腫瘤疾病相關(guān)，但后期研究表明KDM3A是一種多功能蛋白，具有高度調(diào)節(jié)亞細(xì)胞分布和基因轉(zhuǎn)錄作用。它可將多種環(huán)境因素與生理狀態(tài)相結(jié)合，維持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[10-11]。而本課題組前期研究已證實(shí)了KDM3A在心血管疾病中的多種調(diào)控作用，通過下調(diào)KDM3A的表達(dá)，可顯著改善心肌缺血再灌注損傷，故筆者推測(cè)KDM3A可能通過調(diào)控EPCs來發(fā)揮其相應(yīng)的細(xì)胞功能。本研究結(jié)果表明，下調(diào)KDM3A的表達(dá)可顯著增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移、管形成功能，同時(shí)EPCs合成和分泌相關(guān)的促血管形成的細(xì)胞因子VEGF和SDF-1等分泌也有增加。因此，KDM3A具有調(diào)節(jié)EPCs的作用，可能為今后控制和防治心血管疾病提供新的思路。

圖2 下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)EPCs的遷移能力(n=3，×200)

圖3 下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)EPCs體外血管形成能力(n=3，×200)

A、B：下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可以提高EPCs分泌促血管生成蛋因子VEGF、SDF-1的能力；C：下調(diào)KDM3A蛋白可以提高p-Akt蛋白的表達(dá)。與空白組比較，aP<0.05圖4 下調(diào)KDM3A的表達(dá)對(duì)EPCs分泌促血管生成因子能力的影響(n=3)

Akt信號(hào)通路早期在腫瘤疾病中已有廣泛研究[12]。癌細(xì)胞通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵致癌信號(hào)級(jí)聯(lián)，如通過PI3K/Akt信號(hào)級(jí)聯(lián)通路來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和活化[13]。而后期研究者們發(fā)現(xiàn)，Akt信號(hào)通路在癌癥相關(guān)疾病和心血管疾病中的調(diào)控效應(yīng)卻截然相反。癌細(xì)胞持續(xù)的活化和增殖是治療癌癥所需要遏制的方向，但細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和存活是治療大多數(shù)心血管疾病的干預(yù)方向。Akt是心肌中最具特征的激酶之一，它通過旁分泌和自分泌因子的產(chǎn)生影響細(xì)胞功能的各個(gè)方面，包括生長(zhǎng)、存活和增殖，以及代謝、葡萄糖攝取、基因表達(dá)和細(xì)胞間相互作用等，特別是作為各種血管生成細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的下游效應(yīng)物[14-15]。Chu等[16]研究表明，抑制Akt磷酸化可改變骨髓干細(xì)胞的活性并抑制其內(nèi)皮分化。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)KDM3A，EPCs各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)增強(qiáng)的同時(shí)伴隨著p-Akt/Akt蛋白表達(dá)的增高，進(jìn)一步表明KDM3A調(diào)節(jié)EPCs活性與功能的機(jī)制可能與Akt蛋白有關(guān)。

綜上，EPCs對(duì)于調(diào)節(jié)心肌缺血損傷、損傷修復(fù)、逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)、維持心功能、內(nèi)膜完整性、內(nèi)皮功能和預(yù)防心血管并發(fā)癥至關(guān)重要，而下調(diào)KDM3A蛋白的表達(dá)可增加EPCs增殖、遷移和管形成功能，同時(shí)促進(jìn)EPCs分泌促血管形成相關(guān)的細(xì)胞因子，其機(jī)制可能與增加p-Akt/Akt蛋白表達(dá)有關(guān)。然而，本次研究?jī)H僅在細(xì)胞水平上探討了KDM3A對(duì)EPCs功能的調(diào)節(jié)，還需進(jìn)一步經(jīng)在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)除了Akt信號(hào)通路，潛在的其他相關(guān)下游信號(hào)通路也需進(jìn)一步的研究和探索。

利益沖突：無