基于DNA條形碼研究浙江沿海牡蠣的種類多樣性及其分布特征

王航俊，呂寶強(qiáng)，黃 丹，姚煒民

（國家海洋局溫州海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，浙江 溫州325000）

牡蠣屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目、牡蠣總科、牡蠣科，是我國乃至世界產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類［1］。在我國長達(dá)1.8×104km的海岸線上均有牡蠣的分布，作為一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，其野生資源的物種豐度、分布及種質(zhì)遺傳特征等生物多樣性現(xiàn)狀歷來都倍受關(guān)注［1-6］。由于牡蠣的廣棲息性，貝殼易隨其生活環(huán)境的變化而發(fā)生極大的變化，因此僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)或解剖學(xué)等方法難以完全解決牡蠣的分類問題，我國乃至世界的牡蠣分類迄今仍存在較多的爭論［7-10］。

浙江省地處長江口以南、臺灣海峽以北的東海之濱，末次冰盛期后黃渤海生物的南向擴(kuò)張和南海生物的北向擴(kuò)張?jiān)诖私粎R，導(dǎo)致該海域的海洋生物不僅種類豐富，而且具有極高的多樣性水平［11］。前蔡如星等（1991）較為全面記錄了浙江沿海軟體動物的種類數(shù)量，其中包括10種牡蠣［12］。此外其他研究也記錄了幾種不同的牡蠣［13-15］，目前已有記錄的牡蠣不少于13種。然而考慮到形態(tài)學(xué)等傳統(tǒng)分類學(xué)手段鑒定的牡蠣種類可能存在較多的主觀局限性［8］，本研究通過采集浙江沿海的7個(gè)代表性海域的牡蠣，利用DNA條形碼技術(shù)，對獲得的232個(gè)牡蠣樣品進(jìn)行線粒體基因細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（Cytochrome c Oxidase Subunit I，COI）和核基因28S核糖體RNA（28SrRNA）擴(kuò)增和測序，并對所得序列信息進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)關(guān)系分析。確定每個(gè)樣品所屬的屬種名，明確浙江沿海牡蠣的種類分布特征及多樣性水平。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究鮮活牡蠣采自浙江省從北至南的7個(gè)海域，分別為嵊泗（SS）、象山（XS）、頭門（TM）、大陳島（DC）、清江（QJ）、南麂島（NJ）、霞關(guān)（XG）海域，除清江為養(yǎng)殖牡蠣外，其他均為野生牡蠣，采樣海域如圖1所示。同一海域的野生牡蠣采集選取多條不同生境的潮間帶斷面，采樣不分個(gè)體大小。樣品采集做好標(biāo)記后迅速置于-20℃冷藏。

圖1 牡蠣樣品采集點(diǎn)Fig.1 Localities for oysters sampling

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

從牡蠣閉殼肌中取出肌肉組織約100 mg，充分剪碎，用酚-氯仿法提取基因組DNA，使用分光光度儀進(jìn)行濃度及純度檢測。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增獲得線粒體COI基因和核基因28S rRNA基因片段。實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增COI基因所用的引物為LCO1491（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）［16］，其 擴(kuò) 增28S rRNA基因所用引物為D1F（5′-GGGACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3′）和D6R（5′-CCAGCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3′）［17］。PCR反應(yīng)體系（25 mm3）：2.5 mm3PCR Buffer，模板DNA 25 ng，dNTP 0.2μmol/dm3，引物1μmol/dm3，鎂離子濃度2 mmol/dm3，Taq聚合酶1 U，補(bǔ)加雙蒸水至25 mm3。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4.00 min；95℃變性72 s，52℃退火30 s，72℃延伸78 s；35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10.00 min。PCR產(chǎn)物使用試劑盒進(jìn)行純化，并委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。PCR引物作為測序引物。

1.3 序列分析及相似度比對

測序獲得的DNA序列通過Sequencer進(jìn)行比對和人工校正，對位后將堿基序列輸入DnaSP6［18］軟件統(tǒng)計(jì)單倍型和等位基因。利用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）和生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Barcode of Life Database，BOLD）中的BLAST功能對各單倍型序列進(jìn)行序列檢索，基于相似度比對原理進(jìn)行種類鑒定。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離分析

利用本研究中所獲得的COI基因單倍型和28SrRNA等位基因以及NCBI中已經(jīng)錄入的牡蠣序列，基于MEGA 6.06［19］中內(nèi)置的Clustal W程序進(jìn)行多重比對。比對后，經(jīng)剪切形成長度相同的核心序列集，分別用于系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離分析。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA），Kimura 2-parameter model計(jì)算模型，Bootstrap重復(fù)1 000次；遺傳距離使用Kimura 2-parameter model模型進(jìn)行計(jì)算。

1.5 多樣性指數(shù)分析

牡蠣多樣性及其相關(guān)指數(shù)分別采用以下方法處理分析：

式（1、2）中：H′為Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，s為每站位所包含的總物種數(shù)，Pi為第i種的個(gè)體數(shù)與總個(gè)體數(shù)之比值，J′為Pielou均勻度指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 測序結(jié)果

本研究共對232個(gè)牡蠣樣品進(jìn)行擴(kuò)增測序，其中有兩個(gè)大陳島牡蠣樣品未獲得COI基因序列，其余牡蠣樣品均獲得長度為640 bp的COI基因序列和長度為784 bp的28SrRNA基因序列。COI序列形成97個(gè)單倍型（Hap1～Hap97），其中大陳島采樣群體的單倍型數(shù)量最多有30種（表1），在所有樣品中，單倍型Hap13、Hap1、Hap8、Hap16和Hap79出現(xiàn)頻率最高，而有70個(gè)單倍型僅在一個(gè)樣品中出現(xiàn)。232個(gè)28S rRNA序列共發(fā)現(xiàn)42個(gè)等位基因（Hap1～Hap42），南麂島的等位基因最多有21種（表1），主要等位基因?yàn)镠ap12、Hap58和Hap6，出現(xiàn)在172個(gè)樣品中，而有29個(gè)等位基因僅在一個(gè)樣品中出現(xiàn)。

表1 COI基因單倍型和28S rRNA等位基因在各采樣群體的數(shù)量分布Tab.1 Numerical distribution of COI gene haplotypes and 28SrRNA alleles at each sampling group

2.2 序列相似度比對

COI單倍型和28S rRNA等位基因序列分別經(jīng)NCBI和BOLD數(shù)據(jù)庫比對，97個(gè)COI單倍型中的94個(gè)單倍型與8個(gè)確定物種相似度高于99%，2個(gè)單倍型（Hap83、Hap84）與GenBank號為KU310925、KU310924、KU310922的小蠣屬未定種（Saccostrea sp.）序列相似度高于99%，1個(gè)單倍型（Hap82）與GenBank號為JQ027290的小蠣屬未定種序列相似度高于99%；42個(gè)28S rRNA等位基因中2個(gè)等位基因與2個(gè)確定種的相似度高于99%，另外40個(gè)等位基因與3個(gè)屬的不確定種有較高的相似度。經(jīng)COI單倍型比對確定的8個(gè)種分別為巨牡蠣屬（Crassostrea）5種，分別為福建牡蠣（Crassostrea angulata）、近江牡蠣（Crassostrea ariakensis）、長牡蠣（Crassostrea gigas）、日本巨牡蠣 （Crassostrea nippona）和熊本牡蠣（Crassostrea sikamea）；小蠣屬（Saccostrea）2種，分別為多刺牡蠣（Saccostrea echinata）和棘刺牡蠣（Saccostrea kegaki）；牡蠣屬（Ostrea）1種，為疏紋牡蠣 （Ostrea circumpicta）；經(jīng)28SrRNA等位基因比對確定的2個(gè)種分別為熊本牡蠣和密鱗牡蠣（Ostrea denselamellosa），40個(gè)不確定種的3個(gè)屬分別為巨牡蠣屬、小蠣屬和牡蠣屬。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

以新硬牡蠣（Neopycnodnte cochlear）作為外群，分別對97個(gè)COI單倍型和42個(gè)28SrRNA等位基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示?；贑OI單倍型的聚類結(jié)果除了Hap82與小蠣屬的2種聚為一大支，其余單倍型均與確定的物種以97%以上的置信值聚為一支，并且與序列相似度比對結(jié)果一致。另外序列相似度比對中未確定到種的單倍型Hap83和Hap84與多刺牡蠣以100%的置信值聚為一支，表明Hap83和Hap84這兩個(gè)單倍型對應(yīng)物種為多刺牡蠣，單倍型Hap82為小蠣屬未定種?；?8SrRNA等位基因的聚類結(jié)果，除Hap3、Hap4、Hap15和Hap41以99%以上的置信值與已確定的物種明顯的聚在一起外，其余單倍型均與同屬的多種聚為一支；未獲得COI序列的兩個(gè)大陳島牡蠣樣品與密鱗牡蠣以100%的置信值聚為一支。

2.4 遺傳距離分析

依據(jù)序列比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析，可以將232個(gè)牡蠣樣品鑒定為3屬9種和1個(gè)未定種（表2）。使用MEGA 6.06分別計(jì)算基于COI序列和28SrRNA序列的牡蠣兩兩之間的遺傳距離。利用SPSS24繪制牡蠣各分類階元的遺傳距離箱線圖（圖3）。COI序列遺傳距離分析結(jié)果表明種內(nèi)、同屬不同種間和屬間的遺傳距離未發(fā)生重疊，DNA間隙明顯。其中種內(nèi)遺傳距離的平均值為0.008，種內(nèi)遺傳距離均小于0.020；同屬不同種間的遺傳距離平均值為0.108，最大值和最小值分別為0.177和0.025；屬間遺傳距離平均值為0.290，其最大值和最小值分別為0.317和0.246。符合Heber等（2003）認(rèn)為的線粒體COI基因?yàn)镈NA條形碼的最小種間遺傳距離為0.020的閾值［20］，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了利用COI序列進(jìn)行牡蠣樣品分子鑒定的適用性和準(zhǔn)確性。

28SrRNA序列遺傳距離分析結(jié)果表明，各牡蠣之間的遺傳距離明顯小于COI序列的遺傳距離，種內(nèi)遺傳距離的平均值為0.011，最大值和最小值分別為0.082和0.000；同屬不同種間的遺傳距離平均值為0.014，最大值和最小值分別為0.104和0.001。種內(nèi)遺傳距離和同屬不同種間遺傳距離存在DNA重疊，無法用于牡蠣種階元的分類鑒定。28SrRNA屬間遺傳距離平均值為0.077，最小值為0.044，除了少數(shù)屬內(nèi)遺傳距離極值大于0.044外，大部分屬內(nèi)的遺傳距離都小于0.044，因此，28SrRNA可以粗略的用于牡蠣屬階元的分類鑒定。

2.5 討論

2.5.1 條形碼適用性分析 由于牡蠣的外部形態(tài)常隨生活環(huán)境的不同而發(fā)生極大的變化，通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類手段對牡蠣種類的準(zhǔn)確鑒定存在較大困難［8］，因此研究人員很早就開始利用DNA條形碼技術(shù)對其開展分類研究［21-22］。目前Genbank已經(jīng)公開發(fā)表的牡蠣COI序列已經(jīng)超過1 674條，50多種牡蠣可以確定到種。本研究通過測序獲得的COI序列與已經(jīng)公開發(fā)表序列進(jìn)行相似性比較開展種類鑒定，其中97%的牡蠣樣品可以鑒定到種。通過COI序列遺傳距離分析可知，種內(nèi)和同屬不同種間的遺傳距離未發(fā)生重疊，DNA間隙明顯，適用于牡蠣種階元的分類鑒定。28S rRNA的遺傳距離分析表明種內(nèi)遺傳距離和同屬不同種間遺傳距離存在DNA重疊，無法用于牡蠣種階元的分類鑒定，但可以粗略的用于牡蠣屬階元的分類鑒定。

圖2 基于COI序列和28SrRNA序列通過UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree based on COI and 28SrRNA gene sequences by UPGMA method

2.5.2 浙江沿海牡蠣的種類及分布 通過COI序列和28SrRNA序列與數(shù)據(jù)庫序列的比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，浙江沿海共有3屬10種牡蠣，不同牡蠣的空間分布情況存在差異。

熊本牡蠣出現(xiàn)在除清江養(yǎng)殖群體外的所有采樣海域，主要生長在潮間帶的中低潮區(qū)以及潮下帶淺海區(qū)。本研究中熊本牡蠣的數(shù)量占總研究牡蠣數(shù)量的55%，在近岸采樣海域其數(shù)量優(yōu)勢更加明顯，為浙江沿海優(yōu)勢牡蠣種。以往的研究表明熊本牡蠣廣泛分布在江蘇以南包括海南島在內(nèi)的海域［15，23-24］，屬于亞熱帶性種。

福建牡蠣出現(xiàn)在大陳島、南麂島、清江、霞關(guān)和象山5個(gè)采樣海域，為浙江沿海牡蠣的第二大優(yōu)勢種，主要生長在潮間帶中低潮區(qū)。文獻(xiàn)記載福建牡蠣分布在浙江以南沿海［25］，其中核心分布區(qū)為廣東和福建，屬于亞熱帶性種。因其生長快，產(chǎn)量高和適應(yīng)性強(qiáng)成為廣東和福建的重要養(yǎng)殖貝類［4］，本研究的清江養(yǎng)殖牡蠣也均為福建牡蠣。

圖3 牡蠣個(gè)體不同分類階元的遺傳距離箱線圖Fig.3 Box plot of genetic distances for COI gene and 28SrRNA gene of oysters at different taxonomic levels

棘刺牡蠣和多刺牡蠣在大陳島和南麂島采樣海域都有出現(xiàn)，其中多刺牡蠣還在霞關(guān)有分布且數(shù)量相對較多，兩種牡蠣均生長在潮間帶中低潮區(qū)。文獻(xiàn)記載該兩種牡蠣在浙江以南沿海均有分布［10，26］，屬于亞熱帶性種。這兩種牡蠣的左殼表面有半管狀棘或者殼頂光滑棕褐色邊緣有半管狀棘而明顯區(qū)別于不同屬的其他牡蠣。

日本巨牡蠣在國內(nèi)分布數(shù)量很少，目前僅在渤海灣、營口和舟山等地有零星報(bào)道［10，27］，主要生長在潮間帶低潮區(qū)和潮下帶淺海區(qū)，屬于暖溫帶性種。本研究也僅在大陳島的潮下帶和南麂島的低潮帶的4個(gè)樣品中有所發(fā)現(xiàn)。

疏紋牡蠣廣泛分布于日本海域［28］，主要生長在潮間帶低潮區(qū)和潮下帶淺海［26］，屬于暖水性種。本研究在大陳島、南麂島和嵊泗3個(gè)海島的低潮帶均有發(fā)現(xiàn)，表明該種在浙江沿海外側(cè)海島具有較為廣泛的分布。

密鱗牡蠣在廣東以北沿海均有分布［10］，主要生長在潮下帶淺海區(qū)，屬于廣溫廣布種。本研究在大陳島漁民底拖網(wǎng)樣品中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)密鱗牡蠣。

近江牡蠣廣泛分布于全國沿海河口附近的低鹽區(qū)［29］，屬于低鹽廣溫廣布種。本研究僅在大陳島貽貝養(yǎng)殖區(qū)的養(yǎng)殖繩上獲得1個(gè)樣品，這可能與本研究在河口低鹽區(qū)采樣較少有關(guān)。

長牡蠣廣泛分布于長江口以北沿海潮間帶中低潮區(qū)及潮下帶淺海區(qū)［26，30］，而在長江口以南地區(qū)鮮有分布報(bào)道，屬于暖溫帶種。本研究在大陳島港池碼頭獲得1個(gè)樣品。

小蠣屬未定種采自南麂保護(hù)區(qū)核心區(qū)的中潮帶，與NCBI已知序列的相似性比較發(fā)現(xiàn)該種在我國臺灣地區(qū)也有分布。

表2 浙江沿海牡蠣的種類及分布Tab.2 Species and distribution of oysters in coastal Zhejiang

2.5.3 浙江沿海牡蠣的多樣性 通過對浙江沿海7個(gè)采樣海域的牡蠣DNA條形碼鑒定結(jié)果分析各海域的牡蠣多樣性水平，其中南麂島海域的H′最高，其次是大陳島和霞關(guān)，頭門和清江海域的H′最低；J′為霞關(guān)海域最高，其次是南麂島和大陳島，嵊泗最低（表3）。

將本研究取樣的浙江沿海6個(gè)野生牡蠣采集點(diǎn)按南北縱向和按離岸遠(yuǎn)近的水平方向劃分進(jìn)行多樣性分析（表3）。南北走向上牡蠣的H′為浙南海域（南麂島、霞關(guān)）＞浙中海域（大陳島、頭門）＞浙北海域（嵊泗、象山）；J′在浙南海域高于浙中和浙北海域，種類數(shù)為浙中海域最多，其次是浙南海域，浙北海域相對較少。本研究浙中海域的牡蠣種類數(shù)多于浙南海域，其主要原因是由于在大陳島海域采集到了潮下帶的牡蠣樣品，其豐富的采樣生境是導(dǎo)致種類數(shù)較多的重要原因。在離岸遠(yuǎn)近水平方向上，近岸（象山、頭門、霞關(guān)）海域牡蠣和遠(yuǎn)岸（嵊泗、大陳島、南麂島）海域牡蠣在其種類數(shù)、J′和H′均表現(xiàn)為遠(yuǎn)岸大于近岸。浙江沿海不同海域牡蠣分布的多樣性差異與浙江沿海前鰓類軟體動物［31］以及其他潮間帶底棲生物的多樣性分布差異基本一致［32］。形成這種差異的主要原因可能是由于浙江沿海分布著兩種不同的水系，即浙閩沿岸流控制的沿岸低鹽水系和臺灣暖流控制的外側(cè)高鹽水系［33］，近岸和遠(yuǎn)岸水系的差異導(dǎo)致了牡蠣近岸、遠(yuǎn)岸分布多樣性的差異，外側(cè)高鹽水系自南向北影響強(qiáng)度逐漸減弱導(dǎo)致了牡蠣南北縱向分布多樣性的差異。

表3 浙江沿海牡蠣的多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity indexes of oysters in coastal Zhejiang

目前為止僅有少數(shù)幾個(gè)沿海地區(qū)較為系統(tǒng)的開展了牡蠣的DNA條形碼分析鑒定，其中廣西沿海共發(fā)現(xiàn)牡蠣7種［24］，福建沿海發(fā)現(xiàn)4種巨牡蠣屬的牡蠣，且所有的種類均為亞熱帶性質(zhì)的種類或者廣溫廣布種類，沒有北方暖溫帶性質(zhì)的種類，牡蠣區(qū)系組成較為簡單［23］；位于浙江以北的遼寧沿海共有巨牡蠣屬牡蠣2種，分別為廣溫廣布種和北方暖溫帶性質(zhì)種類，牡蠣區(qū)系組成也較為簡單［3-4］。相比較而言，本研究顯示浙江沿海牡蠣有10種，種類多樣性水平明顯高于廣西沿海；其中巨牡蠣屬牡蠣有5種，巨牡蠣屬的種類多樣性水平高于福建和遼寧。同時(shí)浙江沿海的牡蠣不僅有廣溫廣布種，還有南方亞熱帶性質(zhì)種類和北方暖溫帶性質(zhì)種類并存，牡蠣區(qū)系組成更加復(fù)雜。

浙江沿海所處的東海淺海在末次冰盛期由于海平面下降變成陸地與臺灣島相鄰，而臺灣島外側(cè)的基巖海床和東海泥質(zhì)或砂質(zhì)的海床差異明顯，因此形成了臺灣海峽北側(cè)的東海與南側(cè)的南海之間部分海洋生物的地理隔離。末次冰盛期后海平面上升使得已經(jīng)產(chǎn)生分化的不同地理群體甚至已形成不同種或亞種的群體再次跨過臺灣海峽而生活在一起［35-37］。

長江是亞洲第一大河流，長期以來長江口一帶被許多研究學(xué)者作為海洋生物地理區(qū)系劃分的分割線，張璽等（1963）認(rèn)為長江口以北的軟體動物主要為廣泛分布的暖水性種和溫帶種，一些暖水性較強(qiáng)的種一般都停留在長江口以南，不進(jìn)入黃渤海［38］；沈嘉瑞等（1963）認(rèn)為東海的蟹類區(qū)系為熱帶性的，但是許多種類不能越過長江口而北上［39］。Dong等（2012）認(rèn)為長江口限制了嫁（Cellana toreuma）幼體的向南擴(kuò)散而形成不同的地理群體［40］。Ekman（1953）將中國的浙江以北和浙江以南的海域劃歸為兩個(gè)動物地理區(qū)［41］。

由此可見，浙江沿海牡蠣種類的高度多樣性和區(qū)系組成多樣與浙江海域經(jīng)歷的地質(zhì)歷史事件以及緊鄰長江口的特殊的地理位置密切相關(guān)。

3 結(jié)論

通過COI序列和28SrRNA序列與數(shù)據(jù)庫序列的比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，浙江沿海共有3屬10種牡蠣。其中巨牡蠣屬5種分別為熊本牡蠣、福建牡蠣、近江牡蠣、日本巨牡蠣和長牡蠣，牡蠣屬2種分別為疏紋牡蠣和密鱗牡蠣，小蠣屬3種分別為多刺牡蠣、棘刺牡蠣和小蠣屬未定種。各牡蠣物種在空間分布上存在一定差異，熊本牡蠣和福建牡蠣在浙江沿海由南至北，由近岸至遠(yuǎn)岸均有分布，為浙江沿海的優(yōu)勢牡蠣物種，其他牡蠣種類主要分布在離岸較遠(yuǎn)的海島上。浙江各海域牡蠣的多樣性分析表明H′的大小為浙南海域＞浙中海域＞浙北海域，遠(yuǎn)岸海域＞近岸海域。