血清miR-21在多囊卵巢綜合征患者中的表達(dá)及臨床意義*

連 梅 郭玉佳 陳麗紅 陳劍鋒 陳淑賢

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建省福州市 350004

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)是育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌疾病之一,發(fā)病率高達(dá)6%～8%,其中50%～70%的PCOS患者可引起女性生殖功能障礙和內(nèi)分泌代謝紊亂[1-2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類可調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，在卵巢激素的生成、卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、排卵以及黃體功能形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，而激素水平及卵泡發(fā)育的異常是PCOS的主要臨床特征[3]。近期的研究表明，miR-21在PCOS女性中表達(dá)異常，可能與PCOS的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[4]。本研究通過檢測(cè)血清miR-21在PCOS患者中的表達(dá)情況，分析其用于診斷PCOS的臨床應(yīng)用價(jià)值，旨在為PCOS的早期診斷及靶向治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2018年10月在我院未經(jīng)治療的初診PCOS患者150例，年齡22～39歲，平均年齡(27.90±2.80)歲。根據(jù)胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)將150例PCOS患者分為PCOS胰島素抵抗組(n=96，HOMA-IR≥2.57)和PCOS非胰島素抵抗組(n=54，HOMA-IR<2.57)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2003年荷蘭鹿特丹會(huì)議上修訂的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)不孕病史>1年；(3)配偶生殖功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重肝腎疾病、內(nèi)分泌代謝疾病及其他結(jié)締組織?。?2)全身炎性疾病、腎上腺疾病、高泌乳素血癥；(3)近期有激素類藥物服用史。另選擇同期因男方因素不孕而接受體檢的健康女性50例作為對(duì)照組，年齡23～37歲，平均年齡(27.60±2.50)歲。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提?。嚎崭钩槿§o脈血3ml置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫2 500r/min離心15min，分2層，吸取上層血清400μl轉(zhuǎn)移至1個(gè)EP管中，加入1ml提取劑(Trizol)，于-70℃保存。從-70℃冰箱取出上述保存在EP管的細(xì)胞，按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。

1.2.2 miR-21逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR：應(yīng)用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉(zhuǎn)錄已定量的RNA，選用U6作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為15μl，反應(yīng)參數(shù)為：16℃ 30min；42℃ 30min，85℃ 5min。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反應(yīng)體系為20μl：TaqMan MicroRNA Assay1.00μl，cDNA1.33μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00μl，ddH2O 7.67μl，混合后離心放入定量 PCR儀。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)熱10min，95℃變性15s，60℃退火60s，45個(gè)循環(huán)，最后38℃延伸5s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)：全自動(dòng)生化儀檢測(cè)空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)、總膽固醇(Total choiesterol，TC)、三酰甘油(Triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholestorol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholestorol，HDL-C)。

2 結(jié)果

2.1 PCOS組和對(duì)照組基線資料比較 PCOS組HOMA-IR明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PCOS組和對(duì)照組的年齡、BMI、腰圍、臀圍、收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL-C、HDL-C及FBG比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 PCOS組和對(duì)照組基線資料比較

注：1mmHg=0.133kPa。

2.2 PCOS組和對(duì)照組血清miR-21表達(dá)水平比較 PCOS組血清miR-21表達(dá)水平為1.76±0.38，明顯高于對(duì)照組的0.50±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 PCOS胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組血清miR-21表達(dá)水平比較 胰島素抵抗組血清miR-21表達(dá)水平為2.65±0.80，明顯高于非胰島素抵抗組的0.55±0.08和對(duì)照組的0.50±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。非胰島素抵抗組和對(duì)照組血清miR-21表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 血清miR-21對(duì)PCOS的診斷價(jià)值 當(dāng)血清miR-21表達(dá)水平取最佳截值為1.28時(shí)，其診斷PCOS的AUC為0.795(95%CI：0.734～0.854)，敏感度和特異度為76.4%和74.8%。見圖1。

圖1 血清miR-21表達(dá)水平診斷PCOS的ROC曲線

2.5 血清miR-21與HOMA-IR的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，PCOS患者血清miR-21與HOMA-IR呈正相關(guān)(r=0.817，P<0.01)，對(duì)照組血清miR-21與HOMA-IR無明顯相關(guān)(r=0.138，P>0.05)。

3 討論

PCOS是青春期及育齡期最常見的一種復(fù)雜、多因素的內(nèi)分泌紊亂性疾病，是引起育齡期女性不孕的主要原因，對(duì)育齡期女性生理心理健康造成嚴(yán)重影響[5]。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在正常或病理?xiàng)l件下的細(xì)胞和組織中發(fā)揮著重要的作用，能夠調(diào)控多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、死亡，DNA修復(fù)、免疫功能等，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[6]。有研究表明，miRNA在PCOS的血液、卵泡液、顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中異常表達(dá)，其可能通過調(diào)節(jié)生殖、激素分泌和代謝、細(xì)胞增殖和凋亡、卵巢卵泡發(fā)育相關(guān)基因而發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與PCOS的發(fā)病[7]。Concha等[8]研究證實(shí)，miRNA可能通過其靶基因和通路影響卵泡的發(fā)育、顆粒細(xì)胞的凋亡、類固醇激素合成、胰島素敏感性，從而影響PCOS的病理生理過程。另有研究認(rèn)為，miRNA通過對(duì)胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵性蛋白絲裂原活化蛋白激酶、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、胰島素受體底物、蛋白激酶B和促性腺激素釋放激素進(jìn)行調(diào)控，從而使通路異常，導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而促進(jìn)PCOS的發(fā)生和發(fā)展[9]。

本研究結(jié)果顯示，PCOS組血清miR-21表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，提示血清miR-21在PCOS患者中呈高表達(dá)，對(duì)PCOS疾病發(fā)展具有促進(jìn)作用。Naji等[10]研究也表明，miR-21表達(dá)水平與卵母細(xì)胞發(fā)育情況緊密相關(guān)，在PCOS患者顆粒細(xì)胞和卵泡液中異常表達(dá)，可能在PCOS的高雄激素狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。本研究中胰島素抵抗組血清miR-21表達(dá)水平均明顯高于非胰島素抵抗組，提示miR-21與PCOS患者胰島素抵抗的嚴(yán)重程度有關(guān)，其表達(dá)水平越高，PCOS患者胰島素抵抗癥狀越嚴(yán)重。相關(guān)性分析也顯示，PCOS患者血清miR-21與HOMA-IR呈正相關(guān)，由此推測(cè)血清miR-21高表達(dá)與胰島素抵抗相關(guān)，可能是PCOS患者出現(xiàn)胰島素抵抗的重要病理機(jī)制之一。

本研究通過繪制ROC曲線評(píng)價(jià)miR-21表達(dá)水平對(duì)PCOS的診斷效能，結(jié)果顯示當(dāng)血清miR-21表達(dá)水平取最佳截值為1.28時(shí)，其診斷PCOS的AUC為0.795(95%CI：0.734～0.854)，敏感度和特異度為76.4%和74.8%，提示miR-21對(duì)PCOS診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，PCOS患者血清miR-21明顯升高，通過靶向調(diào)控LATS1促進(jìn)PCOS的進(jìn)展，并可作為診斷PCOS的新型非侵襲性生物標(biāo)志物。

綜上所述，PCOS患者血清miR-21表達(dá)水平明顯升高，miR-21高表達(dá)可能參與了PCOS患者胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，對(duì)PCOS診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但miR-21在PCOS中的具體發(fā)病機(jī)制，尚需更多的臨床實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。