不同骨科植入物表面細(xì)菌早期黏附水平比較*

郭慶昕 李煥英 饒華春

福建省泉州市正骨醫(yī)院 362000

骨科植入物是具有高度相容性和耐腐蝕性的特殊固體生物材料，廣泛應(yīng)用于人工關(guān)節(jié)置換、骨折內(nèi)固定等骨科手術(shù)中，植入物相關(guān)感染成為骨科手術(shù)最為棘手的并發(fā)癥之一，同時(shí)手術(shù)切口感染風(fēng)險(xiǎn)也因植入物的存在而大大增加。細(xì)菌在植入物表面黏附、增殖，并分泌胞外多糖等物質(zhì)，形成生物被膜。生物被膜內(nèi)的細(xì)菌可以逃避機(jī)體免疫力、抗菌藥物的作用，形成遷延不愈的植入物相關(guān)感染。為防止植入物相關(guān)感染人們?cè)O(shè)計(jì)了多種方案，包括對(duì)手術(shù)部位和器械消毒的技術(shù)以及使用高度無(wú)菌的層流手術(shù)室。然而，植入物相關(guān)感染的發(fā)生率仍在0.2%～17.3%之間[1-2]。從臨床角度出發(fā)，研究植入物表面生物被膜(biofilm)形成至關(guān)重要。生物被膜形成過(guò)程一般認(rèn)為是兩步模式：首先，細(xì)菌通過(guò)物理化學(xué)相互作用(范德華力、重力、靜電排斥、離子間相互作用)快速地黏附在植入物表面上；其次，細(xì)菌增殖和累積，形成多層細(xì)胞團(tuán)簇的表面分子[3-4]。

本研究擬比較骨科手術(shù)中常用的鈦合金、不銹鋼、鈷鉻鉬合金及高分子聚氯乙烯4種材料表面表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌早期細(xì)菌黏附水平，為植入物相關(guān)感染的預(yù)防和控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品制備 鈦合金、不銹鋼、鈷鉻鉬合金及高分子聚氯乙烯試驗(yàn)材料委托納通醫(yī)療公司制備，直徑10mm、厚度1mm的圓片，所有樣品均拋光處理。

1.2 主要設(shè)備 722分光光度計(jì)(上海精科)、酶標(biāo)儀(TECAN)。

1.3 主要試劑 哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物技術(shù)有限公司)、胰蛋白酶大豆肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司)、結(jié)晶紫(BASO生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)菌株 表皮葡萄球菌(ATCC 35984)、銅綠假單胞菌(PA01)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 生物被膜培養(yǎng):將實(shí)驗(yàn)菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平板37℃孵育過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種于胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)3h，使用分光光度計(jì)將菌懸液吸光值調(diào)至0.2(波長(zhǎng)為600nm)，相當(dāng)于1×105CFU/ml的菌懸液。將30片備好的樣品加入200ml菌懸液中37℃孵育60min，使無(wú)菌PBS緩沖液輕輕漂洗兩次，以去除游離和黏附不牢固的細(xì)菌。將樣品轉(zhuǎn)移入新鮮的TSB培養(yǎng)基中37℃繼續(xù)孵育，分別在2h、4h、6h各取出10片樣品進(jìn)行下一步試驗(yàn)(其中5片用于1.5.2，5片用于1.5.3)。

1.5.2 生物被膜總量評(píng)估:將不同時(shí)間點(diǎn)樣品采用無(wú)菌PBS緩沖液輕輕漂洗2次，自然風(fēng)干，使用95%乙醇固定5min，固定的樣品用0.5%結(jié)晶紫染色5min，蒸餾水洗滌樣品以除去過(guò)量的染料。空氣中自然風(fēng)干后，將5片樣品分別轉(zhuǎn)移入含有1ml 95%乙醇無(wú)菌試管中。將試管以全速渦旋3min，充分脫色。將每管各取200μl懸液加入96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用酶標(biāo)儀以O(shè)D=570nm的波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度值。

1.5.3 生物被膜活菌計(jì)數(shù)：將不同時(shí)間點(diǎn)樣品采用無(wú)菌PBS緩沖液輕輕漂洗2次，自然風(fēng)干，將5片樣品分別加入含1ml 無(wú)菌PBS緩沖液的試管中。為了從樣品中表面去生物被膜，將試管全速渦旋3min，超聲處理5min，并再次全速渦旋3min。將含有生物被膜的溶液按10 000倍稀釋，分別取10μl的稀釋液，使用平板傾注法計(jì)數(shù)生物被膜中的活細(xì)菌數(shù)(CFU×106/ml)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析不同材料之間的差異，吸光度值(n=5)和活菌計(jì)菌(n=5)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物被膜總量 培養(yǎng)2h后，4種骨科材料表皮葡萄球菌形成的生物被膜總量鈦合金(0.07±0.02)、不銹鋼(0.08±0.02)、鈷鉻鉬合金(0.06±0.02)、高分子聚氯乙烯(0.08±0.02)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；銅綠假單胞菌形成的生物被膜總量分別為鈦合金(0.13±0.02)、不銹鋼(0.10±0.02)、鈷鉻鉬合金(0.11±0.04)、高分子聚氯乙烯(0.13±0.04)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4h后，表皮葡萄球菌形成的生物被膜總量高分子聚氯乙烯(0.20±0.03)和不銹鋼(0.18±0.02)高于鈷鉻鉬合金(0.14±0.01)、鈦合金(0.12±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；銅綠假單胞菌形成的生物被膜總量中高分子聚氯乙烯(0.28±0.04)高于鈦合金(0.21±0.03)、不銹鋼(0.20±0.05)、鈷鉻鉬合金(0.21±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)6h后，表皮葡萄球菌初始黏附的生物被膜總量高分子聚氯乙烯(0.26±0.03)高于鈦合金(0.21±0.03)和不銹鋼(0.22±0.03)，最低為鈷鉻鉬合金(0.17±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；銅綠假單胞菌初始黏附的生物被膜總量高分子聚氯乙烯(0.37±0.05)高于鈦合金(0.32±0.04)和不銹鋼(0.29±0.03)，最低為鈷鉻鉬合金(0.24±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三個(gè)不同觀察點(diǎn)上銅綠假單胞菌形成的生物被膜總量均高于表皮葡萄球菌(P<0.05)。如圖1、2。

圖1 表皮葡萄球菌生物被膜總量

圖2 銅綠假單胞菌生物被膜總量

2.2 生物被膜活菌數(shù) 培養(yǎng)2h后，觀察的表皮葡萄球菌在4種骨科材料的黏附活菌數(shù)(CFU×106/ml)，鈦合金(8±2)、不銹鋼(9±3)、鈷鉻鉬合金(6±2)、高分子聚氯乙烯(10±3)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；銅綠假單胞菌黏附活菌數(shù)鈦合金(15±3)、不銹鋼(12±4)、鈷鉻鉬合金(12±3)、高分子聚氯乙烯(13±5)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)4h后，表皮葡萄球菌黏附活菌數(shù)高分子聚氯乙烯(21±4)大于不銹鋼(15±3)、鈦合金(12±3)、鈷鉻鉬合金(12±3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；銅綠假單胞菌黏附活菌數(shù)為高分子聚氯乙烯(28±5)大于鈦合金(23±4)、不銹鋼(22±4)、鈷鉻鉬合金(20±5)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)6h后，表皮葡萄球菌黏附活菌數(shù)高分子聚氯乙烯(41±6)高于不銹鋼(30±5)、鈦合金(21±4)和鈷鉻鉬合金(19±5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；銅綠假單胞菌黏附活菌數(shù)高分子聚氯乙烯(42±4)高于鈦合金(37±5)和不銹鋼(36±2)，最低為鈷鉻鉬合金(31±3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3個(gè)不同觀察點(diǎn)上銅綠假單胞菌黏附活菌數(shù)均高于表皮葡萄球菌黏附活菌數(shù)(P<0.05)。如圖3、4。

圖3 表皮葡萄球菌生物被膜活菌數(shù)

圖4 銅綠假單胞菌生物被膜活菌數(shù)

3 討論

以往生物材料與細(xì)菌生物被膜早期黏附相關(guān)性的研究主要集中于生物被膜信息與表面光滑度之間的關(guān)系[5-6]，粗糙的生物材料表面為細(xì)菌黏附提供了更廣泛的區(qū)域[7]。因此，為了準(zhǔn)確地比較各種植入物表面的細(xì)菌黏附水平，筆者對(duì)所有試驗(yàn)材料進(jìn)行拋光處理。培養(yǎng)2h觀察的結(jié)果顯示，2種實(shí)驗(yàn)菌株在不同的試驗(yàn)材料上均能形成生物被膜，并且形成的生物被膜總量和生物被膜活菌計(jì)數(shù)相似(P<0.05)，因此，筆者推測(cè)各試驗(yàn)材料的表面光滑度相似是2h觀察到生物被膜總量和生物被膜活菌計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異的主要原因。

培養(yǎng)4h后，2種細(xì)菌在高分子聚氯乙烯表面的生物被膜總量均高于鈦合金、不銹鋼、鈷鉻鉬合金(P<0.05)，表皮葡萄球菌的生物被膜活菌計(jì)數(shù)高分子聚氯乙烯表面也高于鈦合金、不銹鋼、鈷鉻鉬合金(P<0.05)，但銅綠假單菌在4種試驗(yàn)材料上的生物被膜活菌計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。金屬材料本身釋放的金屬離子和化學(xué)結(jié)構(gòu)可能具有抑制或延緩細(xì)菌早期黏附的功能，這可能是筆者觀察到2種細(xì)菌在3種金屬材料表面的早期黏附水平低于高分子聚氯乙烯的原因,但銅綠假單胞菌在液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)迅速，在高分子聚氯乙烯表面大量黏附的同時(shí)生物被膜內(nèi)的細(xì)菌也開(kāi)始出現(xiàn)凋亡,是造成本觀察點(diǎn)上生物被膜活菌計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義原因,但也未能排除實(shí)驗(yàn)誤差。繼續(xù)培養(yǎng)6h后，2種觀察菌在高分子聚氯乙烯表面的生物被膜總量和生物被膜活菌計(jì)數(shù)均高于3種金屬材料(P<0.05)，同時(shí)觀察到鈦合金和鈷鉻鉬合金抑制細(xì)菌早期黏附的能力略優(yōu)于不銹鋼。

不同骨科植入物細(xì)菌早期黏附水平不能用某種單一因素來(lái)解釋，而是多種因素共同作用的結(jié)果。研究表明不同植入物的化學(xué)組成、親水性、表面自由能和Z電位等因素，都能影響細(xì)菌的黏附和早期生物被膜形成[8-9]。Schildhauer等報(bào)道，細(xì)菌對(duì)不同金屬植入物的依從性不同[10]，可能是生物材料本身的理化特性決定的，例如金屬材料釋放的金屬離子和某些特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能會(huì)抑制或延緩細(xì)菌的黏附和早期生物被膜形成；Tang等的研究顯示，由于疏水作用力使得細(xì)菌更易黏附于生物材料的親水表面[11]；在牙科領(lǐng)域的研究表明生物材料表面自由能影響著細(xì)菌的黏附功能[12-13]，van Pelt認(rèn)為，表面自由能可能比結(jié)合力更直接相關(guān)[14]，因此其推測(cè)細(xì)菌較難于在具有低表面自由能的鈷鉻鉬合金表面上的黏附和形成生物被膜。

綜上所述，表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌在高分子聚氯乙烯表面早期黏附水平明顯高于其他3種金屬材料，這為骨科植入物相關(guān)感染的預(yù)防和控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。