啤酒花不同外植體篩選及再生體系構(gòu)建

楊軻，陳一酉，汪軍成，姚立蓉，孟亞雄，馬小樂，李葆春，司二靜，王化俊*

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

啤酒花(Humuluslupulus)為?？迫劜輰俣嗄曷圆荼局参?，在我國主要于新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、山東等地栽培[1-2]，既為食品加工原料，又為藥用植物，具有極高生產(chǎn)價(jià)值，但對(duì)栽培技術(shù)要求高、生產(chǎn)難度大、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。啤酒花作為啤酒的主要生產(chǎn)原料，其雌性花序所含α-酸賦予了啤酒獨(dú)特的香味和苦味，同時(shí)能提高啤酒的抑菌防腐和泡沫穩(wěn)定性[3-4]。啤酒花對(duì)多種類型的病原微生物均較敏感，易受病毒侵害，啤酒花潛隱病毒(hop latent virus，HplV)和啤酒花潛隱類病毒(hop latent viroid，HpLVd)為兩大主要病害[5]，嚴(yán)重影響啤酒花品質(zhì)及產(chǎn)量，尤其會(huì)降低啤酒花α-酸含量。因此，利用基因工程技術(shù)培育抗病毒、穩(wěn)產(chǎn)、高質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)啤酒花品種對(duì)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

構(gòu)建穩(wěn)定、高效的植物再生體系是利用基因工程進(jìn)行育種改良的基礎(chǔ)。國內(nèi)外對(duì)啤酒花再生體系研究報(bào)道較少。Skof等[6]使用不定芽再生能力不同的啤酒花品種，對(duì)外植體的選擇和再生培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。宗凱利等[7]在國內(nèi)首次建立了以節(jié)間外植體為供試材料的兩個(gè)啤酒花主栽品種‘麒麟豐祿’和‘青島大花’再生體系。許慧敏等[8]對(duì)‘于勒比特’啤酒花選用不同外植體、不同外源激素及不同培養(yǎng)基進(jìn)行了愈傷組織培養(yǎng)。但啤酒花再生依然存在效率低、周期長(zhǎng)、穩(wěn)定性差的問題，阻礙了基因工程技術(shù)改良啤酒花性狀的發(fā)展。

不同外植體的選擇對(duì)植株再生體系的構(gòu)建至關(guān)重要。Trojak-Goluch等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同外植體類型和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植株再生率有影響。采用菊苣(Cichoriumintybus)子葉為外植體，出愈率顯著提高，達(dá)到93.31%[10]。張旭紅等[11]以歐洲百合(Liliummartagon)無菌苗鱗片為外植體，探究了不同濃度TDZ(噻苯隆，thidiazuron)分別與NAA(萘乙酸，1-naphthaleneacetic acid)和PIC(毒莠定，picloram)組合使用對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，確定了最適再生培養(yǎng)條件。以鱷嘴花(Clinacanthusnutans)幼嫩莖段為外植體，成功提高了鱷嘴花繁育系數(shù)，建立了完整高效的離體快繁技術(shù)體系[12]。柳福智等[13]以甘草(Glycyrrhizauralensis)無菌苗的下胚軸為材料，分析了不同濃度無機(jī)鹽及不同成分間的交互作用對(duì)甘草愈傷組織增長(zhǎng)量的影響。葉興國等[14]研究發(fā)現(xiàn)植物組織培養(yǎng)存在很強(qiáng)基因特異性，明確植物離體培養(yǎng)性狀的調(diào)控及遺傳機(jī)制，有助于提高植株再生率。相關(guān)研究表明，啤酒花不同外植體類型對(duì)其植株再生頻率也有重要影響，不同生長(zhǎng)素濃度及碳源處理下啤酒花試管苗生根移栽成活率差異明顯[15-16]。目前，啤酒花再生體系外植體的研究多選擇節(jié)間和葉盤，而以腋芽為主要外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、構(gòu)建啤酒花再生體系的研究鮮有報(bào)道。

因此，本研究以不同基因型啤酒花種質(zhì)進(jìn)行外植體篩選和再生體系的構(gòu)建，通過激素誘導(dǎo)扦插枝條生根[17]，獲得生根率最佳的種質(zhì)材料；以啤酒花葉片、腋芽和根尖為外植體材料進(jìn)行離體培養(yǎng)，設(shè)置不同激素配比組合，以期篩選出最適啤酒花外植體供體材料并建立高效穩(wěn)定再生體系,為啤酒花種質(zhì)保存，離體快繁及基因工程改良操作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)楊軻等[18]篩選的50份啤酒花核心種質(zhì)的綜合聚類分析，從中獲得性狀優(yōu)異的5份不同基因型種質(zhì)PJ043、PJ267、PJ028、PJ105、PJ274，于2017年開花前取長(zhǎng)度為15 cm左右半木質(zhì)化枝條用于扦插生根，組織培養(yǎng)及快繁再生體系構(gòu)建的原始材料。

1.2 優(yōu)質(zhì)外植體篩選

1.2.1啤酒花扦插枝條誘導(dǎo)生根 針對(duì)上述5份材料，分別剪取15 cm左右半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯的中部枝條各40株，保留2～3葉。用0.2% KMnO4溶液浸泡枝條根部30 min 進(jìn)行殺菌消毒，然后將枝條置于1000 mg·kg-1的乙哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)中浸泡15～20 s，扦插到水中，在20～25 ℃、弱光(1000～2000 lx)培養(yǎng)室誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)10 d后觀察、統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.2啤酒花扦插枝條發(fā)芽 將1.2.1中生根良好的枝條，轉(zhuǎn)入含有微量元素[FeSO4·7H2O 26 μg·L-1、EDTA-2Na 28 μg·L-1、H3BO33.2 μg·L-1、MnSO4·4H2O 1.8 μg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 μg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 μg·L-1、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 μg·L-1]和大量元素(表1)的5種不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)30 d，每5 d更換一次培養(yǎng)液，定期觀察啤酒花扦插枝條的生長(zhǎng)狀況，以蒸餾水培養(yǎng)作為對(duì)照，30 d后觀察枝條發(fā)芽情況。

表1 營養(yǎng)液大量元素組成Table 1 The composition of mineral elements in nutrient solution (mg·L-1)

注：A1為霍格蘭營養(yǎng)液配方; A2為日本園試配方; A3～A5為自制營養(yǎng)液。

Note: A1is Hoagland nutritional formula; A2is Japanese garden test formula; A3-A5are homemade nutrient formula.

根據(jù)1.2.1和1.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇扦插枝條誘導(dǎo)生根和發(fā)芽最優(yōu)異的啤酒花材料用于再生體系構(gòu)建的外植體供體，分別截取啤酒花根尖、葉片、帶腋芽的莖段作為外植體材料。

1.3 外植體愈傷組織誘導(dǎo)

1.3.1外植體的處理 將外植體分別用75%的酒精浸泡30 s后，無菌水沖洗3次，然后加入15% H2O2滅菌25 min后，用無菌水沖洗3次。葉片切成0.5 cm2塊狀，腋芽與根尖切成0.5 cm的小段。

1.3.2愈傷組織誘導(dǎo)激素配比篩選 將1.3.1切取的外植體接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+2 g·L-1PVP(聚乙烯吡咯烷酮，polyvinylpyrrolidone)+0.002 g·L-1谷氨酰胺]上，并添加不同濃度的6-BA(6-芐氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)和IAA(吲哚乙酸，indole-3-acetic acid)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。激素組合模式為B1：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.05 mg·L-1；B2：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.10 mg·L-1；B3：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1；B4：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.10 mg·L-1；B5：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1；B6：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1。每皿接種15個(gè)外植體，3次重復(fù)，25 ℃弱光條件下培養(yǎng)，定期觀察，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況，篩選最佳外植體材料。

1.3.3腋芽愈傷組織激素配比優(yōu)化 為了提高啤酒花腋芽愈傷組織的誘導(dǎo)率，在試驗(yàn)得出最適激素濃度配比基礎(chǔ)上，對(duì)該培養(yǎng)體系的激素濃度進(jìn)一步優(yōu)化，設(shè)置不同的激素類型及濃度配比進(jìn)行腋芽愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選最佳激素組合。激素調(diào)控模式為C1：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C2：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C3：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C4：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C5：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C6：2,4-D 0.3 mg·L-1。每皿接種15個(gè)愈傷，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.3.2。

1.3.4腋芽愈傷組織可溶性糖、可溶性蛋白含量測(cè)定 參照施海濤[19]的方法，測(cè)定各處理腋芽愈傷組織中可溶性糖、可溶性蛋白含量。

1.3.5不定芽的誘導(dǎo) 將1.3.3篩選到的最適培養(yǎng)基獲得的愈傷組織切成5 mm左右的小塊，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1～2代，然后將愈傷組織繼續(xù)切割成5 mm左右的小塊，轉(zhuǎn)接到不定芽分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+20 g·L-1葡萄糖+2 g·L-1PVP+0.002 g·L-1谷氨酰胺+0.1 g·L-1肌醇)上，同時(shí)添加不同激素配比(D1：0.01 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA；D2：0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA；D3：0.05 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；D4：0.10 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；D5：1.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA；D6：1.50 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，每皿接種15個(gè)愈傷，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.3.2，15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷不定芽的分化情況。

1.3.6生根培養(yǎng)與煉苗 不定芽高度達(dá)到2～3 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到生根基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+20 g·L-1葡萄糖+2 g·L-1PVP+0.002 g·L-1谷氨酰胺+2 g·L-1水解酪蛋白+0.1 g·L-1肌醇)上培養(yǎng)，同時(shí)添加不同6-BA和IBA激素組合(E1：0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA；E2：0.1 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA；E3：0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA；E4：0.2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA；E5：0.2 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA；E6：0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA)。每皿接種15個(gè)不定芽，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.3.2。15 d后統(tǒng)計(jì)不定芽生根的分化情況。

待根系長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)，解開封口膜，在室內(nèi)煉苗3 d后，洗去根系附著的瓊脂，移栽到裝有營養(yǎng)土、蛭石(體積1∶1)的花盆中，20 ℃弱光條件下保溫保濕培養(yǎng)7 d左右，待有新葉芽露出后，轉(zhuǎn)至室外，定期澆灌、管理。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒花扦插枝條誘導(dǎo)生根

圖1 不同啤酒花材料扦插枝條激素誘導(dǎo)生根率比較Fig.1 Comparison of hormone-induced rooting rate of cuttings from different hops不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。The different small letters mean significant differences at P<0.05, the same below.

在IBA誘導(dǎo)處理下，啤酒花種質(zhì)PJ028、PJ043、PJ105、PJ267和PJ274生根率差異顯著(P<0.05)，依次為53.33%、72.00%、63.33%、81.67%和85.00%，種質(zhì)PJ274扦插枝條生根率最高(圖1)。由此可確定PJ274為理想的啤酒花扦插枝條材料。

2.2 不同水培液對(duì)啤酒花扦插枝條發(fā)芽率及根系生長(zhǎng)的影響

采用不同水培液對(duì)啤酒花PJ274進(jìn)行扦插培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)芽率并觀察啤酒花扦插枝條根系生長(zhǎng)情況，各處理下根系均生長(zhǎng)狀況良好，呈白色。由表2可知，水培處理下發(fā)芽率、生根數(shù)和根長(zhǎng)均顯著高于蒸餾水對(duì)照(P<0.05)。水培2發(fā)芽率最高，為40%，水培3發(fā)芽率最低，為15%；水培2平均生根數(shù)最高，為72條，水培1、4和5次之，水培3最低，生根數(shù)僅為36條；水培1平均根長(zhǎng)8.92 cm，為水培體系中最高，水培2次之。從這些數(shù)據(jù)可以確定，水培2作為處理對(duì)啤酒花進(jìn)行扦插培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀況良好且發(fā)芽率高(圖2A)。

表2 不同培養(yǎng)體系對(duì)啤酒花生長(zhǎng)的影響Table 2 The analysis of different nutrient solutions on the growth of hops

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。

Note: The different small letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.

2.3 不同激素配比對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.1篩選最佳外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo) 以啤酒花PJ274在水培2中獲得的扦插枝條為材料，葉片切成0.5 cm2塊狀，腋芽與根尖切成0.5 cm的小段，滅菌處理后分別置于添加不同6-BA和IAA激素組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織。3種外植體均能成功誘導(dǎo)愈傷組織形成(表3)，B4無法誘導(dǎo)腋芽和根尖愈傷組織形成，B2是最佳激素組合，并與其他激素差異顯著(P<0.05)，腋芽誘導(dǎo)率最高，為51.11%，愈傷組織生長(zhǎng)致密(圖2B)。

2.3.2誘導(dǎo)腋芽愈傷組織不同激素配比優(yōu)化 為了提高啤酒花腋芽愈傷組織的誘導(dǎo)率，在2.3.1試驗(yàn)得出最適激素濃度配比基礎(chǔ)上，對(duì)該培養(yǎng)體系的激素濃度進(jìn)一步優(yōu)化，設(shè)置不同的激素類型及濃度配比，篩選誘導(dǎo)腋芽愈傷組織的最佳激素組合。結(jié)果表明，激素配比濃度影響愈傷組織的生長(zhǎng)，2,4-D對(duì)啤酒花腋芽愈傷組織無誘導(dǎo)作用。不同激素模式下愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著(P<0.05)，激素組別C3和C6均未能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)啤酒花腋芽愈傷組織形成的最佳激素調(diào)控模式為C4，誘導(dǎo)率高達(dá)86.67%(表4)，不定芽呈嫩綠色且生長(zhǎng)狀況良好(圖2C)，各處理誘導(dǎo)出的愈傷組織中可溶性糖和可溶性蛋白含量隨著誘導(dǎo)率的提高而增加，其中激素組別C4處理下愈傷組織中的可溶性糖(圖3A)和可溶性蛋白含量(圖3B)顯著高于其他激素組別。

表3 不同激素組合對(duì)啤酒花愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on callus induction by hops axillary buds

2.4 不同激素配比對(duì)啤酒花腋芽愈傷不定芽分化的影響

綜合2.2與2.3結(jié)果可知，腋芽為最佳外植體材料。進(jìn)一步用不同激素配比對(duì)啤酒花腋芽愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)獲得不定芽。由表5可得，在6組不同的激素配比中，第3組不定芽分化率最低，為15.56%；第5組啤酒花腋芽愈傷組織的不定芽分化率最高，為66.67%，顯著高于其他組(P<0.05)。因此，最適誘導(dǎo)腋芽愈傷組織分化不定芽的激素配比為D5(表 5和圖2D)。

圖2 啤酒花再生體系構(gòu)建過程Fig.2 Construction process of hops regeneration system A: 水培啤酒花植株Hops seedling under hydroponic culture; B: 腋芽愈傷組織The callus of axillary buds; C: 腋芽愈傷組織繼代The subculture of the callus of axillary buds; D: 芽的分化Differentiation of the bud of hops; E: 根的分化Differentiation of the root of hops; F: 再生植株的移栽Transplantation of regenerated plants.

圖3 不同激素組合誘導(dǎo)的啤酒花腋芽愈傷組織可溶性糖和可溶性蛋白含量比較Fig.3 Comparison of soluble sugar and soluble protein contents in axillary bud callus of hop induced by different hormone combinations

激素濃度Hormone concentration 平均出愈數(shù)Number of callus induced誘導(dǎo)率 Induction rate (%)C13.67±0.3324.44±2.22cC28.67±0.8857.78±5.88bC30.000.00cC43.85±0.5886.67±3.85aC52.33±0.6715.56±4.44cC60.000.00c

表5 不同激素組合對(duì)啤酒花腋芽愈傷組織芽分化的影響Table 5 Effects of different hormone combinations on bud differentiation of axillary bud callus of hops

2.5 不同激素調(diào)控對(duì)啤酒花生根的影響

設(shè)置不同的外源激素組合，對(duì)分化出不定芽的愈傷組織進(jìn)行生根誘導(dǎo)。由表6所示，各激素配比處理均能分化出根，但不同處理間差異顯著(P<0.05)，其中啤酒花腋芽愈傷組織根分化的最佳激素組合為E2(圖2E)，生根率高達(dá)66.67%。

2.6 試管苗移栽煉苗

對(duì)啤酒花試管苗進(jìn)行室內(nèi)煉苗3 d后，移栽到裝有營養(yǎng)土和蛭石(體積1∶1)的花盆中，20 ℃溫室弱光保溫保濕培養(yǎng)7 d，待有新葉芽展露后，轉(zhuǎn)至室外進(jìn)行培養(yǎng)，試管苗移栽成活率可達(dá)80%，植株嫩綠，生長(zhǎng)旺盛(圖2F)。

表6 不同激素組合對(duì)啤酒花腋芽愈傷組織根分化的影響Table 6 Effects of different hormone combinations on root differentiation of hop axillary bud callus

通過外植體選擇、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、生根、煉苗和移栽等步驟，最終構(gòu)建了啤酒花高頻穩(wěn)定的再生體系(圖2)。

3 討論

開展植物再生體系的構(gòu)建，外植體母體的獲取是第一步。近年對(duì)啤酒花再生體系的報(bào)道中，均未涉及啤酒花外植體母體培養(yǎng)的研究，啤酒花主要栽培模式也基本為土培枝條扦插模式[7-8]。水培作為無土栽培中最廣泛應(yīng)用的方式之一，主要特點(diǎn)是以營養(yǎng)液替代土壤提供植物所需養(yǎng)分對(duì)植物進(jìn)行培植，目前世界范圍內(nèi)用水培模式進(jìn)行作物生產(chǎn)的比重顯著提高[20-22]。Barone等[23]采用水培體系研究番茄(Solanumlycopersicum)和兩種微藻在霍格蘭營養(yǎng)液中共培養(yǎng)的相互作用，最終證實(shí)含有生物刺激素的水培體系對(duì)番茄植株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。本研究采用水培模式，設(shè)置5種不同配比水培液，進(jìn)行啤酒花外植體材料的母體培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水培處理下，枝條扦插生根發(fā)芽效率顯著提高，水培營養(yǎng)成分不同，枝條扦插生根長(zhǎng)芽差異顯著，尤其在大量元素Ca(NO3)·4H2O 945 mg·L-1，KNO3809 mg·L-1，MgSO4·7H2O 493 mg·L-1和NH4H2PO4153 mg·L-1水培模式下，扦插枝條最大平均生根數(shù)可達(dá)72條，最高發(fā)芽率為40%，根長(zhǎng)為7.02～8.92 cm。因此，選用適宜的水培模式是進(jìn)行啤酒花扦插枝條快速生根發(fā)芽的有效途徑，與傳統(tǒng)土培相比，便于取材管理，節(jié)省人力物力，提高效率。

本研究以啤酒花扦插生根發(fā)芽的枝條為外植體供體，分離其根尖、葉片、腋芽為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過比較出愈率和愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)帶腋芽的莖段愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)86.67%，該值與菊苣(Cichoriumintybus)腋芽為外植體愈傷組織誘導(dǎo)率33.3%～62.5%相比有明顯提高[10]，也優(yōu)于紅寶石球花報(bào)春(Primuladenticulata)以腋芽為外植體的組織誘導(dǎo)率73.33%[24]。可溶性糖和可溶性蛋白作為植物組織生長(zhǎng)發(fā)育的重要能量供體和營養(yǎng)物質(zhì)，是評(píng)價(jià)植物組織生長(zhǎng)狀態(tài)的重要因素[25]。本研究對(duì)腋芽為外植體，誘導(dǎo)的愈傷組織中營養(yǎng)物質(zhì)可溶性糖和可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)率越高，活性越強(qiáng)，其組織中可溶性糖和可溶性蛋白含量也最高，這與閆永慶等[26]對(duì)西伯利亞白刺(Nitrariasibirica)愈傷組織的耐鹽性分析的結(jié)果相似。因此，可以確定腋芽是啤酒花再生體系構(gòu)建的適宜外植體。

不同激素配比對(duì)植物細(xì)胞分化和生長(zhǎng)方向均有影響，對(duì)植物形態(tài)建成發(fā)育有引導(dǎo)作用[27]。6-BA配合IAA能夠在啤酒花莖段基部誘導(dǎo)出愈傷組織，但芽誘導(dǎo)率低；IBA配合6-BA能使芽誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)提高[28]。許慧敏等[8]發(fā)現(xiàn)激素濃度為6-BA 0.5 mg·L-1+IAA 1.5 mg·L-1時(shí)啤酒花腋芽的愈傷組織誘導(dǎo)率為69.2%。本研究中，6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1的激素配比能夠成功誘導(dǎo)啤酒花葉片、根尖和腋芽產(chǎn)生愈傷組織，出愈率依次為46.67%、48.89%和51.11%。而進(jìn)一步優(yōu)化腋芽愈傷組織誘導(dǎo)激素配比，在含有激素6-BA和IAA 的基礎(chǔ)上，添加適量2,4-D，發(fā)現(xiàn)6-BA 0.1 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2 mg·L-1的激素組合為啤酒花腋芽外植體最佳激素配比，誘導(dǎo)率高達(dá)86.67%，進(jìn)一步說明本研究中啤酒花腋芽愈傷組織誘導(dǎo)激素組合更具優(yōu)勢(shì)。He等[29]以不同濃度6-BA和NAA處理黃柏(Phellodendronchinense)幼苗，結(jié)果表明外源激素的濃度高低對(duì)黃柏幼苗生長(zhǎng)狀況有重要調(diào)控作用。在本研究中優(yōu)選出的6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1激素調(diào)控組合下，啤酒花最佳愈傷組織不定芽分化率為66.67%，而許慧敏等[8]激素配比為IAA 0.25 mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1的MS-B5培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率僅為56%，不定芽的誘導(dǎo)率顯著提高，為進(jìn)一步誘導(dǎo)生根創(chuàng)造了良好條件。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)啤酒花再生體系過程中所需外植體來源、激素配比、培養(yǎng)條件、移栽處理等方面的探索和優(yōu)化。獲得材料PJ274在水培處理下生根發(fā)芽能力強(qiáng)，為組織培養(yǎng)外植體最優(yōu)來源母體，腋芽為最適外植體，在適宜的激素配比處理下，腋芽愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到87.5%，芽的分化率為66.67%，生根率為66.67%，試管苗移栽成活率達(dá)到80%，植株生長(zhǎng)健壯，最終成功建立了以腋芽為外植體的高頻啤酒花再生體系。