蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆與功能分析

張智琦，王珍，張鐵軍，龍瑞才，楊青川，康俊梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

核干因子(nucleostemin，NS)是一種廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中調(diào)控器官生長(zhǎng)和發(fā)育的包含了rRNA前體加工蛋白的大型蛋白復(fù)合體。與rRNA合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)表明它在核糖體生物起源中起著重要的作用[1-2]。同時(shí)，NS主要在與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的干細(xì)胞中表達(dá)，也表明了其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的調(diào)控作用[3]。因此研究NS在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的同源基因MtNSN1在生長(zhǎng)發(fā)育方面的功能，可以為提高苜蓿的產(chǎn)量提供一種新的思路。NS作為原核生物和真核生物中保守的鳥(niǎo)苷三磷酸酶(GTPase)的成員，屬于參與核糖體生物發(fā)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長(zhǎng)的YlqF/YawG GTPase家族[4]。NS首次被發(fā)現(xiàn)于小鼠的干細(xì)胞和部分癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)在抑制小鼠雙微體基因(murine double minute 2，MDM2)活性的條件下，NS在小鼠體內(nèi)的損耗或超表達(dá)會(huì)引起G1-S和G2-M轉(zhuǎn)化的停滯[5]。MDM2是一種E3泛素連接酶，E3泛素連接酶特異性的識(shí)別靶標(biāo)蛋白，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程中也起著重要作用[6-7]。在人體中對(duì)NS家族的研究發(fā)現(xiàn)其包括3種類(lèi)型，即核干因子、類(lèi)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白3(guanine nucleotide binding protein-like 3-like，Gnl3l)和新型核仁GTP酶(novel putative nucleolar GTPase1，Ngp-1)，實(shí)驗(yàn)表明這3個(gè)家族成員在體內(nèi)均與GTP結(jié)合，同時(shí)蛋白間GTP的結(jié)合域是一致的[8]。NS在C端含有一個(gè)酸性氨基酸域(AAA)，在N端含有一個(gè)堿性氨基酸域(BAA)和一個(gè)卷曲線圈域(CC)。后兩個(gè)結(jié)構(gòu)域作為核仁蛋白的重要組成在動(dòng)植物細(xì)胞周期中起著關(guān)鍵的作用[5]。然而與哺乳動(dòng)物不同，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中只發(fā)現(xiàn)NS的兩個(gè)亞家族——類(lèi)核干因子和類(lèi)Ngp-1，沒(méi)有類(lèi)Gnl3l[9]。

擬南芥的類(lèi)核干因子(nucleostemin-like 1，NSN1)具有與哺乳動(dòng)物NS基因相同的結(jié)構(gòu)域，通過(guò)RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)NSN1表達(dá)于植物莖尖分生組織和各種組織原基中；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，NSN1主要定位于核仁中[10-11]。在擬南芥和煙草(Nicotianabenthamiana)中均發(fā)現(xiàn)NSN1的沉默會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)的遲緩和衰老的提前，表明NSN1通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體的生物發(fā)生從而調(diào)控植物生長(zhǎng)和衰老的過(guò)程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NSN1可以與包括雌激素受體共調(diào)節(jié)因子抗體(pescadillo)和EB病毒核抗原1結(jié)合蛋白2(EBNA-binding protein 2，EBP2)在內(nèi)的核糖體蛋白發(fā)生相互作用；而NSN1的缺失則可能通過(guò)延遲60 s核糖體亞基的生物發(fā)生來(lái)抑制翻譯過(guò)程[12-14]。擬南芥突變體nsn1在胚胎發(fā)生的過(guò)程中子葉發(fā)生畸變，同時(shí)葉片極性發(fā)生紊亂[15]。在苗期，nsn1的子葉和葉片向上卷曲，卷曲的葉片在近軸端生長(zhǎng)出分生組織類(lèi)似物的增生結(jié)構(gòu)，同時(shí)在nsn1葉片的近軸端發(fā)現(xiàn)了比野生型植株遠(yuǎn)軸端更長(zhǎng)更大的鋪面細(xì)胞，說(shuō)明NSN1的突變會(huì)導(dǎo)致分生組織和遠(yuǎn)軸端細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的上調(diào)，抑制了子葉邊界和遠(yuǎn)軸端細(xì)胞識(shí)別相關(guān)基因的表達(dá)[9]。nsn1的葉片和根系均有發(fā)育缺陷，產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)器官數(shù)量嚴(yán)重減少，細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)少于野生型，暗示了NSN1是胚胎發(fā)育、子葉和葉片生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的基因[16-17]。

綜上所述，擬南芥的NSN1在植物細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖調(diào)控中起到重要作用。蒺藜苜蓿是一種重要的一年生豆科模式植物，而NS在蒺藜苜蓿中的研究還尚未有人涉足。本研究通過(guò)克隆蒺藜苜蓿中NSN1的同源基因MtNSN1，分析該基因在不同組織中的表達(dá)水平差異，構(gòu)建超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生擬南芥，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)超表達(dá)植株中細(xì)胞周期標(biāo)記基因的表達(dá)情況，以及使用DNA抑制劑博來(lái)霉素來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)其耐受性的改變。旨在初探MtNSN1的表達(dá)模式及其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用，以期為苜蓿產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)

蒺藜苜蓿R108種子購(gòu)于美國(guó)諾貝爾研究所，擬南芥Clombia-0種子保存于本實(shí)驗(yàn)室。挑選健康飽滿的蒺藜苜蓿種子，在細(xì)砂紙上輕輕摩擦，破除種子硬實(shí)。將種子置于浸濕濾紙的玻璃皿中，放入光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗，26 ℃/22 ℃，相對(duì)濕度60%)培養(yǎng)5 d左右。待種子萌發(fā)，將發(fā)芽的幼苗種在1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，置于人工氣候室(20～22 ℃，16 h光照/8 h黑暗)中。每5 d換一次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)至取樣。將野生型擬南芥的種子用10%的次氯酸鈉浸泡10 min消毒，再用超純水沖洗10次。加入0.1%的瓊脂使種子懸浮，將其均勻地種在1/2 MS固體培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱春化48 h，然后放在培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d左右，移入土中，置于人工氣候室培養(yǎng)。

1.2 蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆

根據(jù)Ensembl Plant數(shù)據(jù)庫(kù)中同源基因NSN1的基因序列，用Primer 5設(shè)計(jì)一對(duì)引物MtNS-F/R(表1)。以蒺藜苜蓿R108的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因。將目的基因與pEASY-T5載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有卡那霉素(50 mg·L-1)抗性的固體LB培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單克隆菌株送公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒于-20 ℃保存。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件分析測(cè)序結(jié)果并獲得編碼蛋白序列，并比對(duì)不同物種中MtNSN1同源基因的氨基酸序列; 通過(guò) MEGA 5.0 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析；利用Expasy網(wǎng)站中的ProtParam預(yù)測(cè)蛋白等電點(diǎn)和分子量；用ProtScale進(jìn)行蛋白親疏水性分析。運(yùn)用PredictProtein網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)；利用CBS網(wǎng)站中的TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；利用NPSA-PRABI網(wǎng)站對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 MtNSN1的表達(dá)分析

取開(kāi)花期蒺藜苜蓿的根、莖、葉和花分別提取RNA。以蒺藜苜蓿的actin2作為內(nèi)參基因，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物qPCR-F/R(表1)，用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT(Livak) 方法處理分析。

1.5 MtNSN1的RNA原位雜交

切取培養(yǎng)皿中萌發(fā)3 d的蒺藜苜蓿幼苗的莖尖部分，將其置于福爾馬林-乙酸-乙醇混合液(formalin-aceto-alcohol，F(xiàn)AA)中固定，用不同濃度的乙醇和二甲苯對(duì)材料進(jìn)行脫水和透明處理，然后浸蠟包埋，再用切片機(jī)切片，最終獲得蒺藜苜蓿的莖尖石蠟切片。根據(jù)MtNSN1的序列設(shè)計(jì)一對(duì)片段長(zhǎng)度約為200 bp的特異性良好的探針引物insitu-F/R(表1)，引物上下游分別加上具有T7和SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子的序列。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得正義和反義RNA探針。對(duì)探針RNA和對(duì)照RNA進(jìn)行一定梯度稀釋后進(jìn)行預(yù)雜交試驗(yàn)，確定探針的濃度。對(duì)莖尖石蠟切片進(jìn)行脫蠟，蛋白酶K消化以及脫水處理。用混有探針RNA的雜交液對(duì)切片進(jìn)行雜交，然后洗片，顯色，封片，最后用熒光顯微鏡觀察[18-19]。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in the study

1.6 超表達(dá)載體pMDC83-MtNSN1的構(gòu)建以及對(duì)擬南芥的轉(zhuǎn)化

以含有目的基因的質(zhì)粒作為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)去掉終止密碼子的引物p83-NSN1-F/R(表1)，PCR擴(kuò)增出目的基因。將目的基因切膠回收純化后，通過(guò)入門(mén)載體與最終載體pMDC83連接。用熱激法[20]將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1感受態(tài)中，篩選陽(yáng)性菌株測(cè)序后，獲得超表達(dá)載體pMDC83-MtNSN1，然后提取菌株質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，活化后離心重懸，用花序侵染法[20]轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。收獲轉(zhuǎn)化的擬南芥T1代種子，將其種于含有潮霉素(50 mg·L-1)抗性的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，篩選抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的鑒定

以T1代抗性轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板，用引物p83-NSN1-F/R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)陽(yáng)性植株。以鑒定為陽(yáng)性植株的cDNA為模板，用引物qPCR-F/R進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以擬南芥β-actin(表1)為內(nèi)參基因，每個(gè)處理設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT(Livak) 方法分析。

1.8 MtNSN1基因的功能分析

1.8.1表型分析 將野生型擬南芥和MtNSN1表達(dá)量較高的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代種子于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周。測(cè)量并統(tǒng)計(jì)植株的主根長(zhǎng)度和葉片數(shù)量，每個(gè)株系設(shè)置50個(gè)重復(fù)。

1.8.2細(xì)胞周期標(biāo)記基因的表達(dá)模式分析 根據(jù)對(duì)擬南芥的表型統(tǒng)計(jì)，綜合分析后選擇性狀差異最大并且MtNSN1表達(dá)量最高的株系NSN1-5來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選取4周齡的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥提取植物總RNA，根據(jù)細(xì)胞周期標(biāo)記基因包括3個(gè)細(xì)胞周期基因CYCA2;3、CYCB1;1、CYCD3;1和2個(gè)S期特有基因組蛋白H4基因(HistoneH4)和核糖核酸還原酶編碼基因(ribonucleotide reductase,RNR)的序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR(方法同1.4)。

1.8.3對(duì)DNA抑制劑的耐受性分析 博來(lái)霉素是一種DNA抑制劑，用其處理植物會(huì)導(dǎo)致多種類(lèi)型分子損傷的產(chǎn)生，包括DNA單鏈和雙鏈的斷裂，該抑制劑主要影響細(xì)胞周期的S期[21]。前人研究發(fā)現(xiàn)擬南芥在博來(lái)霉素的處理下，與細(xì)胞周期相關(guān)的基因均有所下調(diào)[22]。將野生型擬南芥和T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子消毒后置于4 ℃春化2 d，種在1/2 MS培養(yǎng)基上，豎直培養(yǎng)2周后，移在含有3，6，9和12 mg·L-14個(gè)濃度博來(lái)霉素抗性的1/2 MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)1周，統(tǒng)計(jì)不同濃度下2個(gè)株系擬南芥的根長(zhǎng)，不同處理各設(shè)置50個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿MtNSN1的生物信息學(xué)分析

MtNSN1是一個(gè) cDNA全長(zhǎng)2193 bp的基因，其中包含一個(gè)1800 bp的開(kāi)放閱讀框，可編碼599個(gè)氨基酸。將該基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp)中的A17生態(tài)型蒺藜苜蓿同源基因的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)堿基差異與3個(gè)氨基酸差異。

生物進(jìn)化樹(shù)分析表明，MtNSN1與大豆(Glycinemax)的氨基酸同源性為66.67%(圖1)。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中G～G5組成的MMR/HSR1域，在古生菌到脊椎動(dòng)物中都有存在(圖1)。采用Expasy網(wǎng)站中的ProtParam預(yù)測(cè)MtNSN1蛋白分子量為133.7 kDa，蛋白偏堿性。通過(guò)ProtScale對(duì)蛋白的疏水性分析表明MtNSN1為親水性蛋白。利用PredictProtein預(yù)測(cè)MtNSN1定位于細(xì)胞核上。采用TMHMM 2.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白無(wú)跨膜區(qū)。利用NPSA-PRABI網(wǎng)站分析知MtNSN1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由44.57%的α螺旋和41.57%的無(wú)規(guī)則卷曲組成。

2.2 MtNSN1的組織差異性表達(dá)分析

利用熒光定量PCR對(duì)蒺藜苜蓿的根、莖、葉和花中的MtNSN1進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，該基因在這些組織中均有表達(dá)。其中MtNSN1在花中表達(dá)量最高，根次之，表達(dá)量約為花中的30%；葉中表達(dá)量最低，僅為花中的10%(圖2)。

2.3 MtNSN1在蒺藜苜蓿莖尖的原位雜交

反義探針在莖尖分生組織中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，顯示出藍(lán)紫色(圖3A)， 而正義探針未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，沒(méi)有顯示出藍(lán)紫色(圖3B)。表明MtNSN1主要表達(dá)在生長(zhǎng)活躍的莖尖分生組織和周?chē)挠啄廴~中。

2.4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與鑒定

在含有潮霉素(50 mg·L-1)抗性的1/2 MS固體培養(yǎng)基上篩選出7株抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)確定以上植株均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，MtNSN1在不同株系中表達(dá)量不同。將7株陽(yáng)性苗分別命名為NSN1-1、NSN1-2、NSN1-3、NSN1-4、NSN1-5、NSN1-6、NSN1-7。其中NSN1-6中MtNSN1表達(dá)量最低；NSN1-5中表達(dá)量最高，是NSN1-6的65倍；NSN1-3表達(dá)量次之，是NSN1-6的9倍(圖4)。

圖1 MtNSN1與其他物種生物進(jìn)化樹(shù)分析和氨基酸序列多重比對(duì)Fig.1 Phylogenetic analysis and amino acid sequence alignment of MtNSN1 with other species A:MtNSN1與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析(方框內(nèi)為蒺藜苜蓿的MtNSN1)； B:MtNSN1與其他物種的氨基酸序列比對(duì)(方框內(nèi)為保守結(jié)構(gòu)域G1～G5)。A:Phylogenetic analysis of MtNSN1 with other species (The frame shows MtNSN1 in M. truncatula); B:Amino acid sequence alignment of MtNSN1 with other species (The frame shows conserved domain of G1-G5).ZmGNL: 玉米 Zea mays NP_001142481; VaGNL: 紅豆 Vigna angularis XM_017584230.1; MtNGP: 蒺藜苜蓿 M. truncatula XP_013467257.1; NGP: 擬南芥 Arabidopsis NP_175706.1; MmGNL3: 小鼠 Mus musculus AY181025.1; HsGNL3: 人 Homo sapiens AAV74413.1; SrGNL3: 線蟲(chóng) Strongyloides ratti XP_024506722.1; OsNSN1: 水稻 Oryza sativa XP_015620869.1; MtNSN1: 蒺藜苜蓿 M. truncatula XP_013467257.1; GmNSN1: 大豆 Glycine max KRG90185; LaNSN1: 狹葉羽扇豆 Lupinus angustifolius XM_019580035.1; NSN1: 擬南芥 Arabidopsis NP_187361.1; NaNSN1_0: 煙草 Nicotiana attenuate XP_019249461; SlNSN1: 番茄 Solanum lycopersicum NP_001234382; SbNSN1: 高粱 Sorghum bicolor XP_002464274.

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析

根據(jù)對(duì)野生型擬南芥以及轉(zhuǎn)基因擬南芥NSN1-2，NSN1-3和NSN1-5的2周齡植株根長(zhǎng)和葉片數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，3個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)明顯多于野生型擬南芥，其中平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)的是NSN1-3，比野生型擬南芥長(zhǎng)大約2 cm(圖5)；3個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片數(shù)量略多于野生型擬南芥，但無(wú)顯著差異。其中平均葉片數(shù)量最多的是NSN1-5(圖5)，比野生型擬南芥多1～2片。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，MtNSN1轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根長(zhǎng)度和葉片數(shù)量均優(yōu)于野生型擬南芥。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥中細(xì)胞周期標(biāo)記基因的表達(dá)分析

圖2 蒺藜苜蓿中MtNSN1的組織差異性表達(dá)分析Fig.2 The relative expression of MtNSN1 in different organizations from M. truncatula不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),下同。Different small letters mean significant differences (P<0.05), the same below.

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代中5個(gè)細(xì)胞周期標(biāo)記基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中5個(gè)細(xì)胞周期標(biāo)記基因表達(dá)量都有不同程度的升高。其中CYCA2;1表達(dá)量升高顯著(圖6)，是野生型擬南芥的70倍；CYCD3;1和H4表達(dá)量次之，是野生型擬南芥的2.5倍多；CYCB1;1和RNR表達(dá)量升高較少，是野生型擬南芥的2倍。

2.7 DNA抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響

轉(zhuǎn)基因株系和WT在博來(lái)霉素濃度從低到高的處理下，根長(zhǎng)越來(lái)越短，說(shuō)明博來(lái)霉素對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)有抑制作用。在同一濃度下比較，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)均長(zhǎng)于WT，表明MtNSN1轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥對(duì)博來(lái)霉素有更強(qiáng)的耐受性(圖7)。

圖3 MtNSN1在蒺藜苜蓿莖尖分生組織的原位雜交定位Fig.3 The localization of MtNSN1 examined in shoot apical meristem of M. truncatula by in situ hybridization A: 反義探針雜交結(jié)果Hybridized with the MtNSN1 antisense RNA probe; B: 正義探針雜交結(jié)果Hybridized with the MtNSN1 sense RNA probe; SAM: 莖尖分生組織Shoot apical meristem; P1，P2: 葉原基發(fā)育的不同時(shí)期The different times of leaf primordium; 標(biāo)尺為50 μm The bar is 50 μm.

3 討論

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥中MtNSN1的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression level of MtNSN1 in transgenic Arabidopsis

蒺藜苜蓿MtNSN1包含一個(gè)1800 bp的開(kāi)放閱讀框，可編碼599個(gè)氨基酸，蛋白分子量為133.7 kDa，蛋白偏堿性。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分析，MtNSN1與大豆親緣關(guān)系最近。氨基酸多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白由5個(gè)保守的GTP結(jié)合基序組成，分別為G1、G2、G3、G4和G5[23]，這樣的結(jié)構(gòu)被命名為MMR/HSR1結(jié)構(gòu)域。

MtNSN1在蒺藜苜蓿不同組織中的表達(dá)量也有所不同，其中在花中的表達(dá)量最高。Wang等[11]的研究表明， 擬南芥NSN1通過(guò)直接或間接控制結(jié)合到隱花基因2(AGAMOUS2，AG2)上的引物蛋白復(fù)合物來(lái)調(diào)控隱花基因(AGAMOUS，AG)。在植物中，干細(xì)胞的活動(dòng)必須通過(guò)花的發(fā)育過(guò)程來(lái)終止，而這一過(guò)程需要激活A(yù)G的表達(dá)，因此AG在花分生組織起始過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[24-25]。這與NSN1編碼的mRNA主要分布于花序分生組織和花原基中，以及該基因?qū)ǖ纳L(zhǎng)發(fā)育起到重要調(diào)控作用這一結(jié)論具有一致性。

圖5 轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的表型統(tǒng)計(jì)Fig.5 The phenotype statistics of transgenic Arabidopsis and WT

圖6 5個(gè)細(xì)胞周期標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression level of five cell cycling marker genes in transgenic Arabidopsis

圖7 不同濃度博來(lái)霉素處理下轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的根長(zhǎng) Fig.7 The root length statistics of transgenic and WT Arabidopsis under different concentration of bleomycin

通過(guò)RNA原位雜交，發(fā)現(xiàn)NSN1在幼苗葉片和莖尖分生組織中有明顯的信號(hào)，表明NSN1在擬南芥參與生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程[9]。本研究利用原位雜交發(fā)現(xiàn)MtNSN1在蒺藜苜蓿的莖尖分生組織及其周?chē)啄鄣娜~中表達(dá)，表明該基因表達(dá)于具有衍化出各類(lèi)組織原基功能的莖尖分生組織中，表明蒺藜苜蓿MtNSN1參與了分生組織的調(diào)控機(jī)制。

通過(guò)研究NSN1對(duì)擬南芥子葉發(fā)育的影響表明，該基因的突變可能對(duì)胚胎發(fā)育的任何階段產(chǎn)生抑制作用。進(jìn)一步研究證明NSN1參與分生組織在胚胎中的發(fā)生過(guò)程以及控制子葉的發(fā)育[9]。Jeon等[12]研究發(fā)現(xiàn)NbNSN1缺失的煙草植株有生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象。本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)MtNSN1轉(zhuǎn)基因擬南芥在主根長(zhǎng)度和葉片數(shù)量上與野生型相比都有增加，表明該基因可能影響植物胚胎及不同器官的生長(zhǎng)發(fā)育。

有文獻(xiàn)報(bào)道[2,13]，在動(dòng)物中缺失或超表達(dá)NS時(shí)細(xì)胞周期會(huì)被抑制，同時(shí)G1-S和G2-M的過(guò)渡階段也發(fā)生阻滯。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中，NS的缺失會(huì)抑制DNA的復(fù)制過(guò)程，同時(shí)擾亂DNA的自我更新，而超表達(dá)NS則對(duì)羥化導(dǎo)致的DNA損傷具有保護(hù)作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，核糖體生物發(fā)生是細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，G1期結(jié)束產(chǎn)生的核糖體數(shù)量控制著G1的S期的轉(zhuǎn)變[27]。本研究通過(guò)DNA抑制劑博來(lái)霉素處理不同的擬南芥株系，發(fā)現(xiàn)MtNSN1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的主根比野生型擬南芥更長(zhǎng)，表明轉(zhuǎn)基因株系對(duì)博來(lái)霉素有更強(qiáng)的耐受性，這種耐受性的提高可能是MtNSN1參與了細(xì)胞周期的調(diào)控造成的。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥NSN1通過(guò)維持細(xì)胞周期的進(jìn)程參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[28]。Wang等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體nsn1表型矮小，且NSN1主要定位于控制細(xì)胞生長(zhǎng)的核仁中。細(xì)胞周期標(biāo)記基因CYCA2;3、CYCB1;1、CYCD3;1、RNR和H4除了控制細(xì)胞周期過(guò)渡外，還在植物細(xì)胞分裂和分化發(fā)育過(guò)程中起著協(xié)調(diào)作用[29]。在nsn1突變體中，細(xì)胞周期標(biāo)記基因的表達(dá)量與野生型擬南芥相比均有所下降[16]。本研究發(fā)現(xiàn)MtNSN1轉(zhuǎn)基因擬南芥中上述5種細(xì)胞周期標(biāo)記基因的表達(dá)量與野生型擬南芥相比均有上調(diào)，表明MtNSN1在轉(zhuǎn)錄水平上影響擬南芥的細(xì)胞周期進(jìn)程。

4 結(jié)論

克隆得到蒺藜苜蓿MtNSN1 的cDNA全長(zhǎng)2193 bp，氨基酸序列比對(duì)表明MtNSN1含有MMR/HSR1結(jié)構(gòu)域，屬于GTPase家族中的RbgA/YlqF/YawG 亞家族。通過(guò)對(duì)MtNSN1在蒺藜苜蓿不同器官中的表達(dá)分析，表明該基因在花中表達(dá)量最高，根次之，葉片中表達(dá)量最低，僅為花中的10%；RNA組織原位雜交顯示，MtNSN1主要在莖尖分生組織及其周?chē)挠啄廴~中表達(dá)，暗示MtNSN1與苜蓿莖尖分生組織維持有關(guān)。超表達(dá)MtNSN1擬南芥的主根長(zhǎng)度和葉片數(shù)目都明顯優(yōu)于野生型，初步說(shuō)明該基因影響地上及地下器官的生長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，超表達(dá)MtNSN1擬南芥中細(xì)胞周期標(biāo)記基因CYCA2;3、CYCB1;1、CYCD3;1、H4和RNR的表達(dá)水平均有顯著上調(diào)。DNA化學(xué)誘變劑處理后，超表達(dá)植株根系受抑制程度小于野生型，表明MtNSN1參與維持細(xì)胞周期的過(guò)程。