異甘草素抑制α-葡萄糖苷酶的分子機(jī)制

韓芬霞，范新景，耿 升，婁文娟，梁桂兆，劉本國(guó),*

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）

α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）又名α-D-葡萄糖苷水解酶，具有水解和轉(zhuǎn)糖苷雙重作用，被廣泛應(yīng)用于乙醇發(fā)酵、低聚糖生產(chǎn)、淀粉水解、食品成分分析、代謝機(jī)理研究和生物診斷等領(lǐng)域[1-3]。α-葡萄糖苷酶參與生物體的糖代謝，對(duì)維持人體的正常生理功能起著重要作用，其在小腸內(nèi)可以催化多糖分解為葡萄糖，由此會(huì)引發(fā)餐后高血糖，而控制餐后高血糖是控制糖尿病患者發(fā)病的重要手段。采用α-葡萄糖苷酶抑制劑，可有效控制α-葡萄糖苷酶的活性，降低II型糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生率[4-5]。目前，臨床上已有一些通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性來(lái)治療糖尿病的藥物，其中研究最為成熟的是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇，這些藥物雖然可以有效降低餐后血糖水平和減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，但毒副作用較大[6-7]。近來(lái)的研究表明，來(lái)源于植物的類黃酮具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性和較低的生物毒性[8-10]。劉杰等采用聚酰胺柱制備青錢柳總黃酮，發(fā)現(xiàn)其α-葡萄糖苷酶抑制活性高于阿卡波糖，可顯著改善小鼠糖耐量，降低餐后血糖濃度[11]。芶琳等發(fā)現(xiàn)富含黃酮的老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用（半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.12 mg/mL），其抑制機(jī)制為可逆混合型[12]。

圖1 異甘草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of isoliquiritigenin

異甘草素（圖1）屬于查耳酮類物質(zhì)，是甘草等藥食兩用植物的重要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、維護(hù)心腦血管等多種生物活性[13-15]。余穎等發(fā)現(xiàn)甘草酸提取廢液的乙酸乙酯萃取物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，推測(cè)與其富含甘草素、異甘草素及其糖苷有關(guān)[16]。但至今鮮有對(duì)于異甘草素抑制α-葡萄糖苷酶的系統(tǒng)研究。鑒于此，本研究擬通過(guò)酶抑制動(dòng)力學(xué)、熒光猝滅等實(shí)驗(yàn)手段考察異甘草素的酶抑制及互作情況，運(yùn)用Surflex-Dock分子對(duì)接法研究異甘草素與酶的結(jié)合模式，將實(shí)驗(yàn)和模擬手段相結(jié)合，以揭示異甘草素抑制α-葡萄糖苷酶的分子機(jī)制。本研究對(duì)推動(dòng)異甘草素在食品領(lǐng)域的應(yīng)用、開發(fā)新型的降糖保健品具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異甘草素、阿卡波糖、對(duì)硝基苯酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-葡萄糖苷酶（來(lái)自釀酒酵母）、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Agilent公司；TU-1810PC紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；GenPure UF/UV純水超純水系統(tǒng) 美國(guó)Thermo Scientific公司；ME104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制效果測(cè)定

對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）作為底物時(shí)可被α-葡萄糖苷酶水解為黃色且在405 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的對(duì)硝基苯酚。參照文獻(xiàn)[17]的方法，分別取1 mL α-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL）與1 mL的10、20、30、40、50 μg/mL異甘草素溶液在試管中振蕩使混勻，對(duì)照管用1.0 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）代替樣品，在37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，而后向試管中加入1 mL底物PNPG（1 mmol/L）溶液，反應(yīng)20 min，最后迅速加入1 mL無(wú)水乙醇使酶失活，終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度?？瞻坠転? mL樣品與1 mL酶混合，加入1 mL緩沖液，最后加入1 mL無(wú)水乙醇使酶失活。每次實(shí)驗(yàn)3 組平行。樣品的抑制率效果用IC50進(jìn)行比較，抑制率按公式（1）計(jì)算。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶的抑制類型判斷

設(shè)定5 個(gè)PNPG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L），固定異甘草素（0、20、50 μg/mL）和α-葡萄糖苷酶含量（0.2 U/mL），測(cè)定反應(yīng)速率，以酶促反應(yīng)速率（1/v）對(duì)PNPG濃度的倒數(shù)（1/[S]）作圖，得Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，以判斷抑制類型。

1.3.3 熒光光譜測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]的方法，將1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液分別與4 mL酶液均勻混合，分別在25、30、37 ℃下反應(yīng)10 min，之后對(duì)其進(jìn)行熒光光譜掃描。激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，掃描范圍是320～380 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm。

1.3.4 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用SYBYL 8.1軟件中Surf l ex-Dock對(duì)接模塊研究異甘草素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式。異甘草素的三維結(jié)構(gòu)預(yù)先用Gaussian 09軟件通過(guò)密度泛函方法（B3LYP/6-31g＋）進(jìn)行優(yōu)化。α-葡萄糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)下載自RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/，PDB編號(hào)4J5T），刪除水分子和非必需子結(jié)構(gòu)，通過(guò)末端處理、加氫、分配原子類型、加電荷等步驟完成受體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備，采用Surf l ex-Dock高精度對(duì)接法，原型分子生成閾值設(shè)為0.5，其余參數(shù)默認(rèn)。對(duì)接后，選取Total score最大且Cscore也較大的構(gòu)象作為研究對(duì)象[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)處理質(zhì)量濃度測(cè)定3 次，使用SPSS軟件的Duncan's法對(duì)結(jié)果的方差顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制效果

圖2 異甘草素（A）和阿卡波糖（B）對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 2 α-Glucosidase inhibitory activities of isoliquiritigenin (A)and acarbose (B)

由圖2可知，隨著質(zhì)量濃度的上升，異甘草素和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率均逐漸上升，當(dāng)異甘草素質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為74.72%，而阿卡波糖在3.0 mg/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制才達(dá)到73.45%，通過(guò)曲線擬合計(jì)算可確定異甘草素和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50分別為（26.44±2.19）μg/mL和（1.22±0.05）mg/mL，異甘草素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力顯著優(yōu)于阿卡波糖，表明其是一種食源性α-葡萄糖苷酶抑制劑，在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

為了研究異甘草素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型，考察了不同質(zhì)量濃度異甘草素存在的測(cè)試體系中，酶催化不同濃度PNPG水解的反應(yīng)速率，經(jīng)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到1/[S]對(duì)1/v的線性回歸關(guān)系（圖3）。隨著抑制劑異甘草素質(zhì)量濃度的上升，異甘草素的米氏常數(shù)Km逐漸增加，最大反應(yīng)速度vm逐漸減小，表明異甘草素采用競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性相混合的方式抑制α-葡萄糖苷酶。Geng Sheng等在研究二氫楊梅素與α-葡萄糖苷酶的互作時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相同的抑制行為[20]。阿卡波糖與寡糖結(jié)構(gòu)相似，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合α-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮抑制作用[21]。而異甘草素不僅可與酶的活性部位相結(jié)合，還可與酶的非活性部位相結(jié)合，阻止產(chǎn)物生成，發(fā)揮抑制作用，因而在酶抑制實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)了更好的抑制效果。

圖3 異甘草素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖Fig. 3 Lineweaver-Burk plot for the inhibition of α-glucosidase by isoliquiritigenin

2.2 熒光光譜分析

熒光光譜法是在接近生理環(huán)境下研究活性小分子與酶間相互作用應(yīng)用最廣泛的方法，其基于小分子引起的酶蛋白內(nèi)源熒光光譜的變化來(lái)獲得二者的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)等信息[22-23]。由圖4可知，隨著異甘草素質(zhì)量濃度的增加，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性降低，表明二者發(fā)生了相互作用。采用Stern-Volmer方程（公式（2））分析不同溫度下的熒光數(shù)據(jù)，獲得相應(yīng)的猝滅常數(shù)（表1）。不同溫度下的猝滅常數(shù)（Kq）均遠(yuǎn)大于生物大分子動(dòng)態(tài)熒光猝滅的最大常數(shù)2×1010L/（mol·s），表明異甘草素通過(guò)與α-葡萄糖苷酶結(jié)合成復(fù)合物，引發(fā)了酶蛋白的靜態(tài)熒光猝滅。

式中：F0為無(wú)猝滅劑時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（au）；F為有猝滅劑時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（au）；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)熒光分子壽命/s；[Q]為猝滅劑濃度/（mol/mL）。

圖4 異甘草素在25（a）、30（b）、37 ℃（c）時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig. 4 Effect of isoliquiritigenin on fluorescence spectra of α-glucosidase at 25 (a), 30 (b) and 37 ℃ (c)

表1 異甘草素與α-葡萄糖苷酶間的熒光猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants between isoliquiritigenin and α-glucosidase

對(duì)于靜態(tài)熒光猝滅過(guò)程，可以使用雙對(duì)數(shù)方程（公式（3））計(jì)算異甘草素與α-葡萄糖苷酶互作過(guò)程的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），相關(guān)結(jié)果見表2。

式中：F0為無(wú)猝滅劑時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（au）；F為有猝滅劑時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（au）；Ka為反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為猝滅劑濃度/（mol/mL）。

表2 異甘草素與α-葡萄糖苷酶間的結(jié)合參數(shù)Table 2 Binding parameters between isoliquiritigenin and α-glucosidase

由表2可知，隨著溫度的升高，異甘草素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)顯著上升，而其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)則略有增加，都穩(wěn)定在1附近，推測(cè)適當(dāng)升溫不僅可以加速二者在溶液中的運(yùn)動(dòng)速率，提高結(jié)合效果，還可令α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)更加伸展，暴露更多的結(jié)合位點(diǎn)。

為了理解異甘草素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合過(guò)程，利用Van't Hoff方程（公式（4））和吉布斯自由能方程（公式（5））獲得了二者互作的熱力學(xué)常數(shù)（表3）。

式中：Ka為反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)/（L/m o l）；ΔH為反應(yīng)的焓變/（k J/m o l）；ΔS為反應(yīng)的熵變/（J/（mol·K））；ΔG為反應(yīng)的吉布斯自由能變/（kJ/mol）；R為氣體摩爾常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為熱力學(xué)溫度/K。

表3 異甘草素與α-葡萄糖苷酶間的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters between isoliquiritigenin and α-glucosidase

異甘草素與α-葡萄糖苷酶互作的自由能變（ΔG）為負(fù)值，表明異甘草素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程，而焓變（ΔH）和熵變（ΔS）為正值，根據(jù)前人總結(jié)的熱力學(xué)規(guī)律[24]，二者的結(jié)合過(guò)程是一個(gè)以熵驅(qū)動(dòng)為主的自發(fā)進(jìn)行的過(guò)程，受疏水作用力驅(qū)動(dòng)，這可能由于異甘草素在結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)疏水性的苯環(huán)，因而在與酶的疏水口袋結(jié)合過(guò)程中，疏水力發(fā)揮了主要作用。

2.3 分子對(duì)接分析

多酚與酶的互作涉及復(fù)雜的結(jié)構(gòu)改變，其中酶可能發(fā)生有序的高級(jí)結(jié)構(gòu)重組，并伴隨能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)分子傳遞等新的變化[25]。目前，多種實(shí)驗(yàn)手段可用于此類研究，如光譜法（包括紫外光譜、熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜、圓二色光譜等）、平衡透析、電泳及色譜等方法，還有新出現(xiàn)的等溫滴定量熱、核磁共振、表面等離子共振等方法[26-27]。但復(fù)雜的條件參數(shù)給研究帶來(lái)了極大困難，近年來(lái)，分子模擬方法成為互作研究的重要工具[28]。近期迅速發(fā)展的ONIOM計(jì)算、分子動(dòng)力學(xué)、分子對(duì)接已被用于研究多酚與酶蛋白的結(jié)合機(jī)制[29]。為了驗(yàn)證前述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究運(yùn)用Surflex-Dock分子對(duì)接法考察了異甘草素與α-葡萄糖苷酶的作用模式。Surflex-Dock對(duì)接法是一種半柔性分子對(duì)接方法，采用經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)和分子相似性搜索引擎考察活性小分子與蛋白間幾何匹配和能量匹配的識(shí)別過(guò)程，確定二者的復(fù)合物構(gòu)象[30]。異甘草素與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果如圖5所示，異甘草素僅與酶蛋白的Asp202和Arg400殘基發(fā)生了氫鍵作用，而與周圍眾多的疏水殘基（Phe147、Phe166、Gly228、Glu271、Phe297、Asp333、Tyr389、Phe397）存在疏水作用，這與熒光猝滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果可推測(cè)，異甘草素的酶抑制機(jī)制包括：1）與α-葡萄糖苷酶的活性口袋結(jié)合后，阻礙了底物的進(jìn)入；2）改變了α-葡萄糖苷酶活性中心的構(gòu)象，降低了酶活力。

圖5 異甘草素與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果Fig. 5 Docking results between isoliquiritigenin and α-glucosidase

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用酶抑制、熒光猝滅以及分子模擬對(duì)接等方法，系統(tǒng)研究了異甘草素抑制α-葡萄糖苷酶的分子機(jī)制。結(jié)果表明異甘草素以競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制相混合的方式抑制α-葡萄糖苷酶，其抑制效果明顯優(yōu)于阿卡波糖。熒光猝滅分析表明在疏水作用力驅(qū)動(dòng)下異甘草素可與α-葡萄糖苷酶結(jié)合生成復(fù)合物，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1。分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)一步表明，異甘草素位于酶的疏水口袋中，與殘基Asp202和Arg400以氫鍵結(jié)合，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持該復(fù)合物結(jié)構(gòu)。本研究對(duì)于開發(fā)新型的食源性α-葡萄糖苷酶抑制劑，推動(dòng)異甘草素在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值。