兒童結(jié)核性腦膜炎腦脊液蛋白質(zhì)差異比較性研究

龔厚武 李玉飛＊

長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 湖南長(zhǎng)沙 410219

在全球范圍內(nèi)，結(jié)核性腦膜炎在肺結(jié)核中占有很大比例，其發(fā)病率和病死率均很高，尤其是在患兒和HIV 感染患者中[1]。而結(jié)核性腦膜炎(結(jié)腦)又是結(jié)核病的最嚴(yán)重類(lèi)型，且兒童易感，但由于結(jié)腦早期臨床表現(xiàn)特異性差，常被誤診為隱球菌性腦膜炎、化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎等疾病而延誤治療。其誤診率高達(dá)31.6～50%，而早期(一周內(nèi))診斷率僅為10%[2]。兒童結(jié)腦患者由于難以得到較多量的CSF，其結(jié)腦的診斷更為困難，使其預(yù)后更差。因此，尋找一種新的快速的診斷結(jié)核性腦膜炎的方法是目前臨床上亟待解決的問(wèn)題。

1 資料與方法

1.1 腦脊液收集

正常兒童CSF 標(biāo)本來(lái)自外科需要腰麻的手術(shù)兒童，所有患兒均無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)，結(jié)腦患兒CSF 抗酸染色陽(yáng)性，或者結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性。標(biāo)本收集量：4ml。標(biāo)本保存：所有標(biāo)本加入蛋白酶抑制劑80μL（sigma），-70℃保存待檢。

1.2 腦脊液樣品制備

包括蛋白提取和蛋白定量。

1.3 雙向凝膠電泳

分別取總蛋白質(zhì)700μg 與水化液充分混合，使總體積達(dá)到450μl，在IPGphor 等電聚焦儀上進(jìn)行等電聚焦，電泳條件為每膠2.5W 恒流電泳30min 后，改用每膠11W 恒流電泳至溴酚藍(lán)離膠底緣約1mm 處停止電泳。

1.4 硝酸銀染色

主要參照蛋白質(zhì)銀染試劑盒操作說(shuō)明。將凝膠小心取下，固定液中過(guò)夜；敏化液中30min；蒸餾水洗滌3 次，每次5min；銀染液中20min；蒸餾水洗滌2 次，每次1min；顯影液中至剛好能看到所有的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；終止液中10min；蒸餾水洗滌3 次，每次5min；保存液中至掃描。

1.5 圖像分析

通過(guò)Imagescanner 掃描儀以及LabScan 掃描軟件對(duì)凝膠進(jìn)行掃描獲取圖像，借助圖像分析軟件PDQuest 7.0 進(jìn)行詳細(xì)分析，比較蛋白質(zhì)斑點(diǎn)差異。以正常患兒CSF 的2-DE 凝膠為參考膠，將結(jié)腦患兒CSF 的凝膠與之進(jìn)行比較。根據(jù)斑點(diǎn)的位置、大小、形狀等參數(shù)，軟件自動(dòng)將不同圖譜中的相同蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配。不能匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（升高或降低200%）視為差異點(diǎn)。

1.6 MALD-TOF-MS

將制備好的點(diǎn)樣板置于Applied Biosystems Voyager System 4307 MALDI-TOF-MS 儀上進(jìn)行分析，采用反射模式，正離子譜測(cè)定，離子源加速電壓為20000V，反射電壓比為1.12，N2 激光波長(zhǎng)337nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100ns，真空度4×10-7Torr，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50 次，質(zhì)譜使用胰蛋白酶自動(dòng)降解離子峰作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正，獲取了肽質(zhì)量指紋圖。

1.7 Database 搜索

應(yīng)用在線軟件Mascot Distiller（http://www.matrixscience.com）進(jìn)行搜索。鑒定結(jié)腦患兒CSF 中結(jié)核相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)分子。

1.8 Western Blot 固相化蛋白質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)證實(shí)

取50 ul 蛋白質(zhì)樣品，在變性聚丙烯酰胺凝膠中垂直板電泳。用水平電泳槽將凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。柯達(dá)X 光膠片感光后自動(dòng)洗片。VDS 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影條帶分析。Western 印跡法可檢測(cè)出1-5ng 的待檢蛋白。

1.9 技術(shù)合成結(jié)核特異性蛋白質(zhì)抗體，制備結(jié)腦特異性蛋白質(zhì)診斷芯片。

2 結(jié)果

正常組與TM 組CSF 2-DE 圖譜見(jiàn)圖表1，實(shí)驗(yàn)中共選出個(gè)20 個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得了20 張肽質(zhì)量指紋圖譜。軟件識(shí)別其有效肽片斷峰后查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索后匹配到蛋白質(zhì)的點(diǎn)有16 個(gè)，其中有4 對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)為同一物質(zhì)分別為2 號(hào)、25 號(hào)載脂蛋白A-I，4 號(hào)、5 號(hào)免疫球蛋白J 鏈，7 號(hào)、9 號(hào)免疫球蛋白γ 輕鏈VLJ 區(qū)，3 號(hào)、6 號(hào)單克隆免疫球蛋白M 冷凝素。

3 結(jié)論

對(duì)比結(jié)腦患兒和正常兒童的腦脊液蛋白質(zhì)組圖譜發(fā)現(xiàn)多處結(jié)核性腦膜炎特異性蛋白，診斷時(shí)使用結(jié)腦特異性蛋白質(zhì)診斷芯片，通過(guò)分析腦脊液蛋白組圖譜提高確診結(jié)核性腦膜炎的速度和準(zhǔn)確性可行。

4 討論

TBM 是由TB 感染所導(dǎo)致發(fā)病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，其由TB 透過(guò)血腦屏障引起軟腦膜、蛛網(wǎng)膜和腦實(shí)質(zhì)等的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非化膿性炎癥，為臨床上常見(jiàn)的肺外結(jié)核病中的最嚴(yán)重類(lèi)型[3]?；冀Y(jié)核性腦膜炎，腦實(shí)質(zhì)、腦血管、脊髓膜也常受累，多發(fā)生于兒童及青少年，TBM 臨床多表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、抽搐、腦神經(jīng)損害及昏迷等，臨床上常采用腦脊液抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、結(jié)核桿菌核酸擴(kuò)增方法尋找病原學(xué)依據(jù)[4]。涂片僅能對(duì)含菌量大于10，00 個(gè)/ml 的標(biāo)本表現(xiàn)出較高的敏感性而培養(yǎng)則需4-6 或8 周的時(shí)間，另外化療所產(chǎn)生的培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、低活力菌和型等非桿菌結(jié)構(gòu)的生物學(xué)性狀的改變更增加了培養(yǎng)的局限性[5]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病能夠顯著影響CSF 中蛋白質(zhì)的濃度以及蛋白質(zhì)存在的表達(dá)。大量的研究證明了人CSF 中的蛋白質(zhì)及多肽在濃度及結(jié)構(gòu)等方面的變化也能反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病理生理信息，是一個(gè)被忽略的、有待開(kāi)發(fā)的寶庫(kù)，可被用于尋找發(fā)病機(jī)制的目標(biāo)蛋白、早期診斷的生物標(biāo)記物。CSF 蛋白質(zhì)成分的改變揭示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程和分子發(fā)病機(jī)制，是目前神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的熱點(diǎn)之一[6]CSF 在于蛛網(wǎng)膜下腔，環(huán)繞著腦和脊髓，主要由脈絡(luò)叢、室管膜分泌產(chǎn)生。包括小分子物質(zhì)、鹽、肽類(lèi)、蛋白質(zhì)和酶，他們?cè)谏磉^(guò)程中發(fā)揮著重要作用。CSF 蛋白質(zhì)存在模式和濃度的改變可以精確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程[7]，通過(guò)CSF 蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為各種中樞神經(jīng)疾病提供了。由疾病特異性蛋白（disease specific proteins， DSPs）制備的結(jié)腦特異性蛋白質(zhì)診斷芯片用于診斷，較常規(guī)抗酸染色法更高效、更靈敏。

圖表1