海島棉纖維均一化酵母雙雜交文庫的構(gòu)建與GbTCP5互作蛋白的篩選

鄭 凱 曲延英 倪志勇 蔡永生 石穎穎 陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830052)

棉花(GossypiumSPP)是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。目前，商用棉花在全球80多個國家都有種植，包括中國、美國、澳大利亞等。中國有著2 000多年的棉花種植歷史，棉區(qū)主要分布在北緯19°～ 45°。隨著品種改良和栽培技術(shù)的改善，我國棉花栽培產(chǎn)量也在穩(wěn)步提升，逐漸進(jìn)入世界高產(chǎn)國行列。海島棉憑借其纖維細(xì)長、富有絲光、強(qiáng)力較高的優(yōu)點，已成為高檔紡織和特種棉紡品的重要原料。由于全球經(jīng)濟(jì)競爭加劇，紡織工業(yè)也對棉花纖維品質(zhì)提出了更高的要求。隨著消費理念的提升，人們對回歸自然的渴望逐漸加劇，也加劇了對純棉紡織品的需求，這都對纖維品質(zhì)改良提出了更加迫切的要求。

環(huán)境條件影響植物的發(fā)育，與植物生長之間的發(fā)展也是動態(tài)平衡的，因此植物生長發(fā)育的可塑性對其生存顯得尤為重要，這就意味著植物調(diào)整其生長之前必須相互感知和權(quán)衡多種環(huán)境刺激。因此，很多調(diào)節(jié)蛋白參與著調(diào)控植物對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，TCP蛋白就參與這種復(fù)雜生理的調(diào)控[1]。TCP是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各類植物中，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。cDNA文庫是篩選和克隆基因cDNA序列的重要方法之一[2]。而構(gòu)建植物特定組織mRNA信息的cDNA文庫，也是研究基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能的有效手段之一[3]。酵母雙雜交是最早由Fields和Song創(chuàng)建的一種研究蛋白互作的技術(shù)[4]，最先應(yīng)用于酵母，然后被推廣到植物和動物的研究中。該方法主要借助遺傳學(xué)方法分析酵母蛋白質(zhì)之間的相互作用，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因組學(xué)等眾多生物學(xué)領(lǐng)域。

TCP家族成員的序列中都含有一個保守的區(qū)域，稱為TCP結(jié)構(gòu)域(TCP domain)。TCP domain由55～59個氨基酸組成，其二級結(jié)構(gòu)是一個堿性區(qū)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(bHLH結(jié)構(gòu)域)，該二級結(jié)構(gòu)能促使TCP家族成員與DNA結(jié)合，并通過其bHLH結(jié)構(gòu)域與其他蛋白相互作用，使TCP家族成員之間形成同源或異源二倍體[5-7]。目前，TCP蛋白已經(jīng)被證實參與植物的生長和發(fā)育、種子的萌發(fā)、茉莉酸的合成以及調(diào)控葉片的衰老[8-9]，還參與配子的發(fā)育[10-11]，并在晝夜節(jié)律和防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[12]。研究人員針對植物中TCP轉(zhuǎn)錄因子家族開展了諸多研究，但所做研究不系統(tǒng)也不完全，因此TCP轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物生長發(fā)育過程的相關(guān)分子機(jī)理的研究尚存在大量空白。海島棉中TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員較多[13]，功能十分復(fù)雜，不同成員之間基因差異很大，且存在冗雜、競爭、互作關(guān)系。此外，棉花的纖維發(fā)育又是一個復(fù)雜的動態(tài)過程[14]，陳全家課題組在前期針對海島棉不同時期纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的研究中發(fā)現(xiàn)，GbTCP5基因在纖維發(fā)育起始期有表達(dá)，但其相關(guān)功能未知。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在棉花TCP轉(zhuǎn)錄因子中，相關(guān)的研究報道甚少。海島棉中的一個GbTCP轉(zhuǎn)錄因子在棉花纖維細(xì)胞伸長階段(5～15 d)高表達(dá)，且該基因能積極調(diào)控茉莉酸的水平，激活纖維和根毛伸長的下游基因，從而使纖維和根毛伸長[15]。而GhTCP14是陸地棉中的轉(zhuǎn)錄因子，主要在纖維發(fā)育的起始階段特異表達(dá)，擬南芥中過表達(dá)該基因時，會改變生長素的分布，同時與生長素合成相關(guān)的基因，如AUX1、PIN2和IAA3的表達(dá)水平也會改變[16]。上述研究表明，GhTCP14可能通過直接調(diào)節(jié)與生長素相關(guān)的GhAUX1、GhPIN2和GhIAA3基因來調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育。因此，針對海島棉中TCP轉(zhuǎn)錄因子的研究顯得至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為海島棉新海21號，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種實驗室提供。2017年4月種植于新疆阿拉爾市農(nóng)一師16團(tuán)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗站，該地區(qū)年日照時數(shù)2 556～2 991 h，無霜期平均在200 d以上，適合海島棉的生長和發(fā)育。

海島棉新海21號播種后實行正常田間管理，參照前期課題組的方法采集纖維樣品[17]，將開花當(dāng)天的棉花花朵掛牌標(biāo)記為0 d，分別采取新海21號開花當(dāng)天(0 d)胚珠，以及開花后5、10、15、20、25、30、35 d的纖維組織，每個時期取2個重復(fù)。剝開棉桃取樣時迅速將纖維與胚珠分離，立即將棉花纖維放置液氮中保存?zhèn)溆?。室?nèi)采樣的新海21號需先將種子剝?nèi)シN皮，將種仁浸泡于70%無水乙醇消毒3 min，然后用無菌水反復(fù)沖洗3～5次，再將種子平鋪在放有濾紙的發(fā)芽盒中，28℃暗培養(yǎng)4 d后取下胚軸，剩余的移植到營養(yǎng)液中繼續(xù)生長，待子葉完全展開時取樣，提取RNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 海島棉不同發(fā)育時期的纖維總RNA提取 使用RNA prep Pure plant Kit試劑盒[天根生物(北京)有限公司]，從液氮中取出海島棉開花當(dāng)天(0 d)胚珠，以及開花后5、10、15、20、25、30、35 d的纖維組織，迅速放于裝有液氮的研缽中充分磨碎。稱取適量的粉末置于2 mL無菌無酶的離心管中提取總RNA(具體方法參考說明書)，用DNaseⅠ處理RNA以除去基因組DNA。

表1 本試驗所需的引物匯總Table 1 Primers required for the experiment

注：表中下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點。

Note: The underlines in the table indicate restriction endonuclease sites.

1.2.2 海島棉GbTCP5基因的克隆及表達(dá)特性 根據(jù)海島棉TCP家族的分類，得知GbTCP5基因的登錄號為Gbscaffold9879.8.0，于美國華盛頓州立大學(xué)棉花基因數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)中海島棉全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得1個cDNA序列。根據(jù)獲得的海島棉GbTCP5 基因的cDNA序列設(shè)計引物，用引物GbTCP5-F 和GbTCP5-R 擴(kuò)增GbTCP5 基因的ORF。

根據(jù)GbTCP5基因的cDNA序列設(shè)計引物GbTCP5-qF和GbTCP5-qR，以GbUBQ7為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物為GbUBQ7-F和GbUBQ7-R(表1)，利用實時熒光定量PCR，以不同時期的纖維組織，以及根、莖、葉、下胚軸、須根和開花當(dāng)天的花瓣、花萼、托葉的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，檢測GbTCP5基因在不同組織和不同發(fā)育時期棉纖維中的表達(dá)情況。熒光定量PCR擴(kuò)增體系：混合液2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL(全式金生物公司)，校正液Passive Reference Dye(50×)0.4 μL(全式金生物公司)，正反引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。PCR擴(kuò)增采用兩步法，參考陳煒等[18]的方法并稍作改動：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。采用2-△△CT法[19]計算該基因在不同棉花組織和不同棉纖維時期的表達(dá)情況。試驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 雙鏈cDNA的合成 1)合成cDNA第一鏈。準(zhǔn)備高質(zhì)量的總RNA，在無菌的微量離心管中加入4.0 μL試劑(含2 μL高質(zhì)量RNA樣品、1.0 μL CDS Ⅲ引物和1 μL的ddH20)并混勻。將上述混合液置于72℃條件下孵育2 min，然后在冰上冷卻2 min，14 000×g短暫離心10 s；取9.0 μL反應(yīng)混合物(含2.0 μL 5×First-Strand Buffer、1.0 μL 100 mmol·L-1DTT、1.0 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix 和1.0 μL SMART MMLV Reverse Transcriptase，ddH2O補(bǔ)足至9.0 μL)與上步的混合液輕彈混勻，然后置于42℃條件下孵育10 min，再加入 1 μL SMARTIII引物混勻，繼續(xù)42℃孵育1 h，于75℃反應(yīng)10 min終止第一鏈的合成，冷卻至室溫，最后加入1 μL RNaseH (2個單位)，于37℃條件下孵育20 min，完成cDNA第一鏈的合成(此時樣品可立即進(jìn)行下一步試驗，也可凍存于-20℃冰箱)。

2)準(zhǔn)備LD-PCR，擴(kuò)增雙鏈cDNA。配置以下混合物：2 μL第一鏈 First-Strand cDNA、70 μL Deionized H2O、10 μL 10× Advantage 2 PCR Buffer、2 μL 50× dNTP Mix、2 μL 5′PCR Primer、2 μL 3′PCR Primer、10 μL 10× Melting Solution及2 μL 50× Advantage 2 Polymerase Mix，ddH2O補(bǔ)足至100 μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，65℃退火6 min(每個循環(huán)+5 s)，25個循環(huán)；68℃延伸5 min。將5 μL PCR產(chǎn)物點樣，在120 Ⅴ/100 mA條件下于1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)量。剩余95 μL cDNA樣品使用一個CHROMA SPIN TE-400純化柱進(jìn)行純化回收，加入20 μL去離子水溶解后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 均一化cDNA文庫的構(gòu)建 構(gòu)建均一化文庫：采用Evrogen公司(俄羅斯)的DSN酶對ds-cDNA進(jìn)行均一化處理(具體方法參照說明書)，將均一化的ds-cDNA與pGADT7-Rec線性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞中，參照文庫構(gòu)建試劑盒(Yeast makerTMYeast Transformation System 2) (Clontech公司，大連)操作說明，按照每板150 μL的量將得到的菌液涂布于100 mm SD/-Leu固體培養(yǎng)基。預(yù)計涂布100個平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，待酵母菌落長到2～3 mm時，向每個平板加入5 mL預(yù)冷的含25%甘油的YPDA培養(yǎng)基，均勻鋪平，室溫靜置1 min，然后使用刮鏟將轉(zhuǎn)化子收集到一個滅菌的500 mL三角瓶中。

均一化文庫的滴定檢測：取10 μL文庫菌液，分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、10 000倍，然后涂布于SD/-Leu平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母的生長狀況。分別統(tǒng)計平板上的菌落個數(shù)，計算酵母雙雜交cDNA文庫的文庫容量和濃度。

1.2.5 誘餌載體pGBKT7-GbTC5的構(gòu)建 根據(jù)酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7的限制性內(nèi)切酶位點，再結(jié)合GbTCP5基因序列酶切位點特性，選取NcoⅠ、EcoRI作為兩者的限制性內(nèi)切酶位點，在基因的ORF兩端設(shè)計特異引物，通過PCR獲得目的片段。將酶切回收后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pGBKT7片段按照1∶3的比例進(jìn)行混合，22℃連接10 min，構(gòu)建酵母轉(zhuǎn)錄激活載體pGBKT7-GbTC5。

1.2.6 pGBKT7-GbTC5毒性及自激活檢測和酵母轉(zhuǎn)化 自激活檢測：以pGBKT7為陰性對照載體，將誘餌質(zhì)粒(pGBKT7-GbTCP5)和對照質(zhì)粒(空載體pGBKT7)分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞后涂布于一缺培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d后長出菌落，挑取單菌落于無菌水中，然后取10 μL用無菌水稀釋的單菌涂布于三缺培養(yǎng)基，倒置放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，觀察單菌的生長情況。

毒性檢測：從SD/Trp培養(yǎng)基上挑取單克隆在液體SD/Trp培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每間隔5 h測定一次菌液OD600值，觀察兩者在20 h后的OD600值。若兩者OD600的值都大于1，說明誘餌表達(dá)載體對酵母細(xì)胞無毒性，反之則有毒性。

共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：將以上鑒定的含有誘餌載體的Y2H Gold菌株與文庫菌株Y187進(jìn)行雜交，用SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培養(yǎng)基篩選，具體步驟:從轉(zhuǎn)化后的SD/-Trp平板上挑取一個直徑為2～3 mm酵母菌落，接到50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，然后于30℃條件下250～270 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8(培養(yǎng)時間約16～20 h)后，離心收集細(xì)胞，棄去上清液，再用4～5 mL SD/-Trp重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度大于1×108個·mL-1。室溫水浴解凍一管文庫菌株，將1 mL文庫菌和4～5 mL誘餌菌(目的基因的酵母載體)共同加入2 L無菌三角瓶中，然后加入45 mL含50 μg·mL-1Kan+的2×YPDA液體培養(yǎng)基，在30℃條件下慢速(30～50 r·min-1)振蕩培養(yǎng)20～24 h。培養(yǎng)20 h后，取5 μL培養(yǎng)物，用40×顯微鏡觀察。如果出現(xiàn)雜合體，停止培養(yǎng)，如果沒有，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心收集雜交培養(yǎng)的細(xì)胞，用10 mL 0.5×YPDA/Kan+液體培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，估算重懸液的總體積，然后分別取100 μL經(jīng)10倍、100倍、1 000倍和10 000倍稀釋的雜交培養(yǎng)產(chǎn)物涂布于100 mm的SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp(DDO)固體培養(yǎng)基上，將剩余的培養(yǎng)物按每個DDO/X/A平板涂布150 μL，共涂布55～60個平板，30℃培養(yǎng)3～5 d，篩選藍(lán)色陽性克隆。

1.2.7 酵母質(zhì)粒的提取與回轉(zhuǎn)驗證 用酵母DNA提取試劑盒(Clontech公司，大連)提取陽性克隆質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后提取質(zhì)粒與pGBKT7-GbTCP5共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade+X-a-gal平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d觀察其生長情況。對回轉(zhuǎn)驗證成功的陽性克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 分析，尋找同源序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉不同發(fā)育時期的纖維總RNA

8個時期的纖維RNA，在A260/280的峰值均在1.8～2.1之間，屬于高質(zhì)量的RNA。為進(jìn)一步檢查不同時期的纖維RNA質(zhì)量，將提取的不同時期的RNA置于0.1%瓊脂糖膠上，經(jīng)電泳檢測(圖1)，條帶清晰，無降解，符合后續(xù)建庫試驗要求。

注：M：Maker 2 000 bp；1～8分別表示開花當(dāng)天(0 d)的胚珠及開花后5、10、15、20、25、30、35 d的纖維RNA。Note: M: Maker 2 000 bp. 1-8 represent the ovules of 0 day of flowering (0 d) and the fibrillar RNA at 5, 10, 15, 20, 25, 30 and 35 days, respectively.圖1 海島棉纖維不同發(fā)育時期的RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoresis map of Gossypium barbadense fiber at different developmental stages

2.2 海島棉GbTCP5基因的克隆與表達(dá)分析

以新海21號開花5 d棉花纖維cDNA為模板，根據(jù)海島棉基因組數(shù)據(jù)庫信息，設(shè)計引物GbTCP5-F和GbTCP5-R，用PCR方法獲得目的片段。GbTCP5基因編碼區(qū)長1 392 bp(圖2)。借助實時熒光定量PCR方法分析GbTCP5基因在棉花不同纖維時期以及不同營養(yǎng)器官和生殖器官中的表達(dá)情況。由圖3可知，GbTCP5基因在海島棉纖維發(fā)育起始期和伸長期(0～ 5 d)的表達(dá)量較高，而在海島棉纖維初生壁向次生壁轉(zhuǎn)化的時期(5～ 20 d)表達(dá)量呈現(xiàn)降低趨勢，推測該基因可能在纖維發(fā)育的起始期(0～ 5 d)發(fā)揮著功能。此外，GbTCP5基因在次生壁增后期(20～25 d)和脫水成熟期(30～35 d)表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，猜測GbTCP5基因可能與加速植株成熟或者激素代謝存在著聯(lián)系。

Note：M: Marker 2 000 bp. 1: GbTCP5.圖2 海島棉GbTCP5基因PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.2 Electrophoresis of PCR product of GbTCP5gene in Gossypium barbadense

圖3 海島棉纖維不同發(fā)育時期中GbTCP5的表達(dá)分析Fig.3 GbTCP5 expression analysis in fibers of Gossypium barbadense at different developmental stages

由圖4可知，GbTCP5基因在海島棉生殖器官中的表達(dá)量高于營養(yǎng)器官，其中在花萼中的表達(dá)量最高，其次是花瓣。此外，GbTCP5基因在棉花幼苗須根中的表達(dá)量高于主根，這可能是須根上的根毛相對主根較發(fā)達(dá)所致。

圖4 海島棉不同組織中GbTCP5基因的表達(dá)分析Fig.4 GbTCP5 expression analysis at of Gossypium barbadense different tissues

2.3 均一化cDNA的效果檢測

DSN酶能夠選擇性地降解ds-cDNA和DNA-RNA雜交體中的DNA，因此在構(gòu)建酵母cDNA文庫時，要先對DSN酶活性進(jìn)行檢測。由圖5可知，泳道4添加DSN后，能夠有效地降解高豐度的DNA，表明DSN酶具有活性，后期能達(dá)到均一化效果。

注：1：Marker 15 000+2 000 bp； 2：不添加加DSN酶； 3：添加失活DSN酶；4：添加活性DSN酶。Note: 1: Maker 15 000+2 000 bp. 2: No addition of DSN enzyme. 3: Addition of inactivated DSN enzyme.4: Addition of active DSN enzyme.圖5 DSN酶活檢測Fig.5 DSN enzyme activity test

在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，通過長距離PCR合成雙鏈cDNA并進(jìn)行純化，結(jié)果見圖6。泳道1～2的ds-cDNA經(jīng)過DSN均一化處理后，電泳呈現(xiàn)一條均勻彌散的條帶，長度分布在500～1 000 bp之間，說明泳道1～2的cDNA在未均一化之前的亮帶已經(jīng)消失，同時也說明均一化后高豐度的cDNA含量下降，使原本豐度較低的cDNA相對含量得到增加，證明均一化質(zhì)量良好，可用于均一化文庫的構(gòu)建。

注：1、2是經(jīng)過DSN均一化處理后，再經(jīng)CHROMA SPIN+TE-400純化柱分選后的ds-cDNA；3、8是15 000 bp的Maker；4是未經(jīng)均一化處理的PCR產(chǎn)物；5是未經(jīng)均一化處理但經(jīng)過CHROMA SPIN+TE-400純化柱分選后的ds-cDNA；6、7是經(jīng)過DSN酶均一化處理后的PCR產(chǎn)物。Note: 1 and 2 are ds-cDNA after sorting by CHROMA SPIN+TE-400 purification column after DSN homogenization. 3 and 8 are 15 000 Maker. 4 is a PCR product that has not been homogenized. 5 is a ds-cDNA which has not been homogenized but has been sorted by CHROMA SPIN+TE-400 purification column. 6 and 7 are PCR products after homogenization by DSN enzyme.圖6 均一化cDNA文庫的ds-cDNA凝膠電泳圖Fig.6 Ds-cDNA gel electrophoresis map of homogenized cDNA library

2.4 均一化cDNA文庫的構(gòu)建

將均一化的ds-cDNA與線性質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞中，將所得雜交培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行10倍、100倍、1 000倍和10 000倍、100 000倍稀釋后，涂布于直徑為100 mm的SD/-Leu培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖7。稀釋10倍和稀釋100倍的SD/-Leu培養(yǎng)基上生長的單克隆較多，無法統(tǒng)計；稀釋10 000倍的平板長出61個單克隆。均一化cDNA文庫的滴度為9.1×107cfu·mL-1，符合標(biāo)準(zhǔn)(>2×107cfu·mL-1)，庫容量為9.15×107cfu·mL-1，符合建庫庫容標(biāo)準(zhǔn)(>1×106cfu·mL-1)，構(gòu)建的文庫所得到的單克隆數(shù)目大于107cfu·mL-1，滿足酵母雙雜文庫的要求，可用于后期的蛋白互作篩選。隨機(jī)從一個平板中挑取34個單克隆以通用引物通過PCR驗證插入片段大小(圖8)，驗證結(jié)果表明，文庫重組率約為100%，插入片段的大小為500～2 000 bp，平均值為750 bp。

注：A：文庫酵母菌原液；B～F分別表示稀釋10倍、100倍、1000倍、10 000倍、100 000倍的文庫酵母菌。Note: A: Library yeast stock solution. B～F: Representative of the library yeast diluted 10 times, 100 times, 1 000 times, 10 000 times and 100 000 times, respectively.圖7 不同稀釋度文庫的滴度檢測Fig.7 Titer detection of different dilution libraries

注：M: Marker 2 000 bp; 1～17 為插入片段PCR擴(kuò)增。Note: M: Marker 2 000 bp. 1-17 indicate insert PCR amplification.圖8 均一化cDNA文庫插入片段大小檢測Fig.8 Uniform cDNA library insert size detection

2.5 誘餌載體的構(gòu)建

以GbTCP5的cDNA為模板，以帶有NcoⅠ、EcoRI酶切位點引物擴(kuò)增獲得GbTCP5基因1 392 bp 片段。將此片段克隆入pGBKT7 載體，篩選陽性克隆，得到pGBKT7-GbTCP5誘餌質(zhì)粒。誘餌質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ、EcoRI雙酶切成8 692 bp 和1 392 bp兩個片段，片段大小與預(yù)計相符(圖9)。測序分析結(jié)果顯示，閱讀框無誤，表明誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：M：Marker；1：pGBKT7-GbTCP5菌液PCR；2：pGBKT7-GbTCP5質(zhì)粒DNA雙酶切。Note: M: Marker. 1: pGBKT7-GbTCP5 bacterial solution PCR. 2: pGBKT7-GbTCP5 plasmid DNA double digestion.圖9 酵母表達(dá)載體pGBKT7-GbTCP5的 PCR產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物的電泳分析Fig.9 Electrophoresis analysis of PCR Product and double digested products of yeast expression vector pGBKT7-GbTCP5

2.6 重組載體pGBKT7-GbTC5毒性及自激活檢測

為了檢測重組質(zhì)粒pGBKT7-GbTCP5是否存在自激活活性，將pGBKT7-GbTCP5轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中，分別涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His平板上培養(yǎng)3～5 d(圖10)，結(jié)果顯示，空載和目的載體在一缺培養(yǎng)基SD/-Trp上能長出酵母菌落，說明載體成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。緊接著將SD/-Trp培養(yǎng)基上生長的菌落轉(zhuǎn)移到三缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ade/-His+X-gal平板上，發(fā)現(xiàn)除了陽性對照能生長變藍(lán)，其余均無菌落長出(圖11)，表明重組質(zhì)粒pGBKT7-GbTCP5轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中沒有自我激活活性。

圖10 酵母表達(dá)載體pGBKT7-GbTCP5與空載pGBKT7在SD/-Trp的生長情況Fig.10 Growth of yeast expression vector pGBKT7-GbTCP5 and empty pGBKT7 in SD/-Trp

圖11 酵母表達(dá)載體pGBKT7-GbTCP5的轉(zhuǎn)錄激活檢測Fig.11 Detection of transcriptional activation of yeast expression vector pGBKT7-GbTCP5

酵母試驗表明，GbTCP5基因無自激活活性，但不能確定是否對共生體有毒性。因此，針對pGBKT7-GbTCP5菌株的毒性做了進(jìn)一步檢測，發(fā)現(xiàn)誘餌質(zhì)粒酵母菌株和空質(zhì)粒pGBKT7的AH109酵母菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到24 h后，二者的OD600值分別為2.466和2.306，差異不顯著(P>0.05，圖12)，說明重組誘餌載體對酵母菌的生長無毒害作用。

圖12 酵母表達(dá)載體pGBKT7-GbTCP5的毒性檢測Fig.12 Toxicity detection of yeast expression vector pGBKT7-GbTCP5

將構(gòu)建的文庫菌和誘餌菌共同加入到一個2 L無菌三角瓶中，加入45 mL含50 μg·mL-1Kan+的2×YPDA液體培養(yǎng)基，置于30℃搖床50 r·min-1培養(yǎng)20 h后，通過細(xì)胞計數(shù)板統(tǒng)計，酵母雙雜共培養(yǎng)液中酵母細(xì)胞密度達(dá)到7.9×109，已經(jīng)達(dá)到酵母單細(xì)胞密度(>109)。取少量細(xì)胞在40倍顯微鏡下鏡檢，酵母雜交出現(xiàn)經(jīng)典的三葉草形狀(圖13)。停止培養(yǎng)，取出菌液，在超凈臺中將菌液按每個DDO/X/A平板涂布150 μL，共涂布55～60個平板，30℃培養(yǎng)3 d。根據(jù)文庫菌液能在SD/-Leu缺陷培養(yǎng)基上生長，誘餌載體能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長，而二者的融合體能在SD/-Trp/-Leu生長的特點，分別統(tǒng)計3種培養(yǎng)基上的細(xì)胞個數(shù)，計算得出酵母雜交率為3.8%。

注：A：酵母雙雜交的經(jīng)典三葉草型結(jié)構(gòu)圖；B：稀釋100倍后的酵母雙雜共培養(yǎng)液中的細(xì)胞。Note: A: Classical clover-type structure diagram of yeast two-hybrid. B: Cells in yeast double-hybrid co-culture solution diluted 100-fold.圖13 酵母雙雜交細(xì)胞的鏡檢Fig.13 Microscopic examination of yeast two-hybrid cells

2.7 GbTCP5互作蛋白的篩選及回轉(zhuǎn)驗證

將誘餌載體pGBKT7-GbTCP5和文庫菌雜交后，涂布于SD/-Trp/-Leu平板上觀察其生長狀況，隨后將二缺平板上的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有X-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷型平板上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右，經(jīng)過3次營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基的初步篩選，獲得9個陽性克隆(圖14-A)。此時提前制備好酵母的感受態(tài)細(xì)胞，將獲得9個陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，再進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗證，最終只有4個陽性克隆(圖14-B)。

通過對陽性克隆進(jìn)行測序和序列比對分析發(fā)現(xiàn)，最終獲得4個與GbTCP5相互作用的蛋白。其中，有3個基因是TCP轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)海島棉中TCP轉(zhuǎn)錄因子命名規(guī)則[13]，分別命名為GbTCP20、GbTCP42和GbTCP45，還有一個是GbAHP1基因。

TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)主要通過協(xié)同作用和拮抗作用參與植物的各種生理活動，為進(jìn)一步研究與GbTCP5互作的其余TCP蛋白之間的關(guān)系，根據(jù)測序結(jié)果分別設(shè)計GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45基因的RT-qPCR引物，在棉花纖維中觀察這3個TCP基因的表達(dá)特性(圖15)。結(jié)果表明，GbTCP20和GbTCP45與互作的GbTCP5基因有著相同的表達(dá)趨勢，說明這2個TCP基因與GbTCP5之間通過協(xié)同作用參與纖維的發(fā)育。而GbTCP42基因與GbTCP5的表達(dá)趨勢相反，二者可能以拮抗作用的形式參與纖維發(fā)育。通過表達(dá)模式僅初步探究了它們之間的作用模式，而其中的作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

圖15 海島棉纖維不同發(fā)育時期的GbTCP基因的表達(dá)分析Fig.15 GbTCP expression analysis in fibers of Gossypium barbadense at different developmental stages

3 討論

研究表明，TCP家族之間可能存在許多蛋白-蛋白相互作用，并且這些TCP優(yōu)先選擇與本類的TCP結(jié)合[20]，即Ⅰ類TCP優(yōu)選與Ⅰ類TCP互作，Ⅱ類TCP優(yōu)選與Ⅱ類TCP互作[21]。例如在擬南芥中AtTCP14和AtTCP15通過相互作用影響植株的節(jié)間長度和葉形[22]。此外，在植物中TCP蛋白常與其他蛋白以互作的形式參與植物的生長發(fā)育，例如在擬南芥中AS2與AtTCP3通過互作參與調(diào)控葉片的發(fā)育[23]。本試驗進(jìn)一步驗證了該結(jié)論，在海島棉纖維中與GbTCP5互作的蛋白多數(shù)是TCP家族蛋白，這也說明在海島棉纖維發(fā)育期間，并不是單一的TCP轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)揮作用，很可能是同一家族的多個轉(zhuǎn)錄因子之間相互協(xié)調(diào)參與調(diào)控纖維的發(fā)育。本試驗成功構(gòu)建得到的文庫滴度為9.15×107cfu·mL-1，達(dá)到了文庫篩選要求，從文庫的鑒定結(jié)果來看，此次構(gòu)建的文庫重組率為100%，插入片段大小在500～2 000 bp之間，使用誘餌表達(dá)載體篩選到4個候選的互作蛋白，說明文庫構(gòu)建成功，這為進(jìn)一步研究TCP家族在棉花纖維發(fā)育中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

TCP也是目前植物中僅存的一類具有特異性的轉(zhuǎn)錄因子家族。作為一類古老的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，TCP蛋白廣泛存在于多細(xì)胞的藻類植物和苔蘚類植物中[24]，但在這些物種中，TCP家族只有幾個成員。在裸子植物和被子植物中，由于基因的復(fù)制和進(jìn)化，TCP家族成員的個數(shù)也在增加[25-27]。目前，已在擬南芥[28]、水稻[29]、楊樹[30]、番茄[31]、西瓜[32]、意大利紅門蘭[33]、高粱[34]、雷蒙德氏棉[35]、亞洲棉[36]、陸地棉[37]、鷹嘴豆[38]及桃樹[39]等植物中鑒定到20個以上的TCP成員。本研究中，海島棉中有75個TCP成員[13]，已知TCP基因參與棉花纖維的發(fā)育，并且在纖維發(fā)育期間有著不同的表達(dá)特性，但其相關(guān)功能及作用機(jī)制尚不清楚。

在研究TCP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點時，發(fā)現(xiàn)ClassⅠ和ClassⅡ類TCP基因有共同的結(jié)合位點序列，且不互相排斥，這說明在植物中至少有一類潛在的基因被Ⅰ和Ⅱ類TCP基因靶向。既然有協(xié)同作用，那么也可能存在拮抗關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥Ⅰ類TCP轉(zhuǎn)錄因子AtTCP20和Ⅱ類AtTCP4基因與LOX2基因的啟動子結(jié)合后，在轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片發(fā)育的初期中發(fā)現(xiàn)AtTCP4與AtTCP20的表達(dá)相反，其中LOX2基因的表達(dá)量在葉片發(fā)育的4～14 d持續(xù)增加，說明LOX2受AtTCP4的直接拮抗調(diào)控[40]。例如擬南芥AtTCP15與AtTCP20之間以功能冗雜的形式共同調(diào)節(jié)葉片的衰老過程[41]。

研究表明，TCP蛋白在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著拮抗和協(xié)同作用，這些生理過程中轉(zhuǎn)錄因子與TCP互作的蛋白質(zhì)目前尚不清楚，因此借助酵母雙雜技術(shù)，在海島棉纖維中篩選轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白顯得非常重要。本試驗成功構(gòu)建了纖維發(fā)育期間的均一化酵母雙雜交文庫，篩選到了與TCP5互作的蛋白，進(jìn)一步證明該系統(tǒng)在研究棉花纖維發(fā)育期間蛋白互作篩選候選蛋白方面具有重要意義。后續(xù)研究將對篩選的蛋白逐一進(jìn)行驗證，通過互作蛋白來研究GbTCP5基因參與棉花纖維發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。

棉花纖維的生長發(fā)育過程決定了成熟纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。近幾年，針對棉纖維發(fā)育的相關(guān)研究備受關(guān)注，但截至目前，控制纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因和調(diào)控機(jī)理仍不清楚。因此發(fā)現(xiàn)和驗證這些參與纖維發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)，是研究棉花纖維發(fā)育的重要一步，這對今后開展棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了海島棉不同發(fā)育時期的纖維均一化酵母雙雜交文庫，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到4個與GbTCP5互作的蛋白，其中3個蛋白屬于TCP家族，另外1個是作為細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要組成部分的GbAHP1基因。從這些基因在纖維中的表達(dá)特性來看，都參與棉花纖維的早期發(fā)育，可能在胚珠表皮細(xì)胞分化時發(fā)揮著重要作用。這對為今后開展海島棉GbTCP5基因參與棉花纖維發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。