蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員的全基因組分析及逆境脅迫響應(yīng)

韓雯毓 李國(guó)瑞 風(fēng) 蘭 閆星伊白英俊 李孟建 孫佳欣 陳永勝,2,*

(1 內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古自治區(qū) 通遼 028000；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心/ 內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 通遼 028000)

WOX(WUSCHEL-related home-obox)轉(zhuǎn)錄因子是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)具有重要作用[1]。WOX蛋白來(lái)自Homepbox(HOX)超家族，其具有由60～65個(gè)氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)(T-L-X-L-F-P-X-X，其中X代表任一氨基酸)的保守結(jié)構(gòu)域。WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中廣泛存在，目前已在擬南芥、水稻、玉米等[1]植物中得到鑒定。研究表明WOX轉(zhuǎn)錄因子與植物器官形成、干細(xì)胞分裂、胚胎發(fā)育等生命進(jìn)程密切相關(guān)[2]。WOX家族可分為三個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化支，即現(xiàn)代進(jìn)化支(Modern clade)、中間進(jìn)化支(Intermediate clade)和古代進(jìn)化支(Ancient clade)。研究表明，擬南芥AtWOX1與AtWOX3可以調(diào)控葉片發(fā)育過(guò)程中側(cè)生組織的發(fā)育，AtWOX9可以維持分生細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂[3]；AtWOX14和AtWOX4可調(diào)節(jié)形成層和原形成層分生組織的分化[4-5]。

蓖麻(RicinuscommunisL.)為大戟科一年生或多年生草本植物[6]，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥及紡織等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7-8]，也是可再生生物能源的優(yōu)質(zhì)材料[9]。大部分石油產(chǎn)品均可由蓖麻油及其洐生物制備而獲得，被人們譽(yù)為極具開(kāi)發(fā)潛力又可再生的“綠色石油”[10]。隨著耕地的減少、世界能源的日益緊缺，蓖麻作為唯一可替代石油的農(nóng)作物產(chǎn)品，遺傳改良其重要農(nóng)藝性狀和培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的抗逆品種是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)的重要方法[11]。盡管目前在擬南芥、水稻等模式植物中已有關(guān)于WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在系統(tǒng)發(fā)育規(guī)模及其功能的研究報(bào)道，但關(guān)于蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族全面的分子進(jìn)化研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)手段對(duì)蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析其蛋白保守結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、家族進(jìn)化及其在干旱與鹽脅迫下根、莖、葉不同組織的表達(dá)模式，旨在更好地了解WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在蓖麻中的進(jìn)化歷史與多樣性，為蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在逆境響應(yīng)中的功能研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蓖麻植株材料由內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，基因組文件下載自蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://castorbean.Jcvi.org/index.php)。擬南芥WOX轉(zhuǎn)錄因子序列下載自TAIR(http://www. Arabidopsis.org/)。水稻W(wǎng)OX轉(zhuǎn)錄因子序列下載自PlantTFDB (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)。

1.2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與理化性質(zhì)分析

通過(guò)蓖麻基因組文件構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，WOX隱馬爾科夫模型(PF00046)下載自Pfam[12](http://pfam.xfam.org)。采用HMMER提取蓖麻基因組中的WOX蛋白序列，將所得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，去除冗余序列。為確保序列準(zhǔn)確性，將含有WOX結(jié)構(gòu)域的序列提交至SMART再次進(jìn)行鑒定[13]。最后將含有WOX結(jié)構(gòu)域的序列在PlantTFDB中進(jìn)行比對(duì)與分析，進(jìn)一步鑒定其是否屬于蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族。利用ExPASy Proteomics (http://web.expasy.org/compute_pi)在線工具對(duì)WOX家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析[14]。

1.3 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育分析

將蓖麻WOX蛋白分別命名為RcWOX1～RcWOX11，通過(guò)ClustalW將擬南芥、水稻與蓖麻的WOX蛋白序列進(jìn)行比對(duì)[15-16]；利用MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000，其他為默認(rèn)參數(shù)。

1.4 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

利用在線軟件GSDS (Gene Structure Display Server 2.0 http://gsds.cbi.pku.edu.cn)與MEME5.2(http://meme-suite.org)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析[17]。

1.5 前處理試驗(yàn)

以蓖麻2129品系為試驗(yàn)材料，采用盆栽法，待蓖麻長(zhǎng)出4片真葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行處理。干旱脅迫組采用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液+30%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)處理；鹽脅迫組采用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液+0.2 mol·L-1NaCl進(jìn)行處理；對(duì)照組采用等體積的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆灌。在處理0、3、6、9、12、24 h后采集根、莖、葉樣品，立即液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蓖麻WOX家族基因的表達(dá)分析

按照RNA提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)說(shuō)明書提取蓖麻根、莖、葉RNA，逆轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒[TaKaRa(日本)公司]說(shuō)明書進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑[TaKaRa(日本)公司]在7500熒光定量PCR儀(北京賽默飛世爾有限公司)上完成，以蓖麻18S為內(nèi)參基因，引物序列詳見(jiàn)表1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；利用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定及其理化性質(zhì)分析

利用HMMER軟件提取蓖麻WOX蛋白序列，利用Pfam和SMART確定含有WOX結(jié)構(gòu)域的蛋白，去除冗余序列后，將序列與PlantTFDB中WOX轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)，最后鑒定到具有典型WOX結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族成員共11個(gè)，分別將其命名為RcWOX1～RcWOX11。由表2可知，RcWOX6蛋白序列最長(zhǎng)(401 aa)，分子量也最大，RcWOX1蛋白序列最短(163 aa)；等電點(diǎn)為5.35～10.00，其中55%為堿性蛋白質(zhì)。推測(cè)的蛋白分子量為19 451.27～45 168.8 kDa，脂肪族氨基酸指數(shù)為44.34～82.02。蓖麻WOX家族蛋白質(zhì)的親水性平均值為-0.429～-1.163，說(shuō)明其均為親水蛋白質(zhì)，但在親水程度上存在差異。

表2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族成員的鑒定及特征Table 2 Characteristics and identification of WOX transcription factors in castor

2.2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為揭示蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族的進(jìn)化關(guān)系，以擬南芥與水稻的WOX轉(zhuǎn)錄家族成員為參考，對(duì)鑒定的11個(gè)含有蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族成員的同源異型結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA7.0進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)擬南芥與水稻中的報(bào)道，WOX蛋白分為三個(gè)亞家族，分別為古代進(jìn)化支、中間進(jìn)化支與現(xiàn)代進(jìn)化支。由圖1可知，在蓖麻RcWOX蛋白家族中，古代進(jìn)化支與中間進(jìn)化支各有2名成員，分別為RcWOX10、RcWOX11與RcWOX7、RcWOX9，現(xiàn)代進(jìn)化支包括RcWOX1、RcWOX2、RcWOX3、RcWOX4、RcWOX5、RcWOX6及RcWOX8共7名成員。

圖1 蓖麻與擬南芥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)化樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree of WOX gene family in castor and Arabidopsis thaliana

2.3 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

由圖2可知，同一進(jìn)化支內(nèi)成員的基因結(jié)構(gòu)均較保守，且內(nèi)含子、外顯子數(shù)存在差異。RcWOX9、RcWOX11、RcWOX6分別含有2、3、4個(gè)外顯子，表明WOX基因功能的多樣性可能是由于基因家族進(jìn)化過(guò)程中外顯子的丟失或增加導(dǎo)致的。對(duì)5個(gè)保守基序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同成員均含有約65個(gè)氨基酸殘基組成的同源異型結(jié)構(gòu)域，且不同分支的保守結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)的數(shù)、種類均具有高度一致性，即系統(tǒng)發(fā)育分析可靠性較高。但對(duì)一些分支，有些基序是獨(dú)特存在的，如基序4是古老進(jìn)化支特有的，基序3是中間進(jìn)化支特有的，從某種程度上講，這些基序可能對(duì)進(jìn)化支起重要作用，且對(duì)基因功能的多樣性也具有一定作用。

圖2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Gene structure and conserved motif of WOX transcription factors in castor

2.4 蓖麻WOX基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果選取古代進(jìn)化支成員RcWOX9，中間進(jìn)化支成員RcWOX10與現(xiàn)代進(jìn)化支成員RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8共5個(gè)基因檢測(cè)其在30% PEG處理下不同時(shí)間RNA水平上的表達(dá)情況。由圖3可知，5個(gè)基因在3種組織中均有表達(dá)，且在不同組織中的表達(dá)模式存在差異性。在未脅迫處理下，5個(gè)基因均在根中相對(duì)表達(dá)量最高，且RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX10在根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量依次表現(xiàn)為根>莖>葉；RcWOX9在莖中相對(duì)表達(dá)量最低。干旱脅迫誘導(dǎo)RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9表達(dá)，處理時(shí)間3 h時(shí)RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中相對(duì)表達(dá)量迅速上調(diào)；RcWOX2在處理9 h內(nèi)莖中的相對(duì)表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，之后隨著脅迫處理時(shí)間的增加持續(xù)下調(diào)。干旱脅迫抑制RcWOX10的表達(dá)，隨著脅迫處理時(shí)間的增加，其在根中的相對(duì)表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)。

圖3 干旱處理下蓖麻RcWOX基因的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of RcWOX genes under drought treatments

圖4 鹽處理下蓖麻RcWOX基因的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of RcWOX genes under salt treatments

2.5 蓖麻WOX基因在鹽脅迫下的表達(dá)分析

由圖4可知，在鹽脅迫下，5個(gè)基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，不同脅迫處理時(shí)間下根中RcWOX2和RcWOX9的相對(duì)表達(dá)量均高于莖和葉，且根中RcWOX2的相對(duì)表達(dá)量隨著脅迫處理時(shí)間的增加持續(xù)上調(diào)；隨著脅迫處理時(shí)間的增加，RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，RcWOX10則在鹽脅迫處理后的9 h內(nèi)急劇下降，之后又呈升高的趨勢(shì)。

3 討論

全基因組分析已成為研究某些物種的基因家族最基礎(chǔ)的工具[18]。WOX轉(zhuǎn)錄因子作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)激反應(yīng)具有重要作用[19]。AtWUS是擬南芥WOX家族轉(zhuǎn)錄因子中最早被鑒定的成員，Haecker[20]利用WUS同源異型盒進(jìn)行同源搜索得到14個(gè)編碼WUS同源異型盒開(kāi)放閱讀框，將與WUS同源異型結(jié)構(gòu)域具有38%～67%一致性和62%～87%相似性的蛋白命名為WOX蛋白家族，并將其根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分為古代進(jìn)化支、中間進(jìn)化支與現(xiàn)代進(jìn)化支三個(gè)進(jìn)化支。本研究從蓖麻基因組中鑒定出11個(gè)WOX成員，在古代進(jìn)化支、中間進(jìn)化支和現(xiàn)在進(jìn)化支分別有2、2和7個(gè)成員，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與擬南芥[21]、番茄[22]、水稻[23]等模式植物類似。對(duì)不同成員理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同蛋白之間均存在差異。其中RcWOX6和RcWOX7是由同一基因LOC8286328編碼而成，這可能是由RNA的選擇性剪接造成[24]。研究表明，WOX轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物分生組織的調(diào)控?，F(xiàn)代進(jìn)化支的成員AtWUS和AtWOX5可以在根尖分生組織中維持干細(xì)胞穩(wěn)定性[25]；在中間進(jìn)化支中，AtWOX11在形成層中特異性表達(dá)，可促進(jìn)不定根的形成[26]。在古代進(jìn)化枝中，AtWOX13可促進(jìn)果實(shí)的胚胎發(fā)育[27]。不同物種進(jìn)化支的緊密聚類表明其具有共同的起源，從直系同源基因的進(jìn)化結(jié)果來(lái)看，RcWOX10可能與果實(shí)胚胎發(fā)育有關(guān)[28-29]，蓖麻RcWOX4可能參與根的生長(zhǎng)與發(fā)育[30]，推測(cè)其可能在根的干旱與鹽脅迫響應(yīng)方面具有重要作用。

已有研究表明，干旱處理下，幾乎所有水稻OsWOXs基因在處理12 h時(shí)均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。鹽脅迫能誘導(dǎo)OsWOX3和OsWOX5上調(diào)表達(dá)[31]。本研究中，干旱脅迫誘導(dǎo)RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9的表達(dá)，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)3 h時(shí)RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中表達(dá)量迅速上調(diào)，說(shuō)明這些基因能在干旱脅迫中快速響應(yīng)。鹽脅迫下，5個(gè)基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，RcWOX2在根中的表達(dá)量隨著脅迫處理時(shí)間的增加持續(xù)上調(diào)，說(shuō)明逆境脅迫誘導(dǎo)該基因表達(dá)；隨著脅迫處理時(shí)間的增加，RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中的表達(dá)量均呈先上升后降低的趨勢(shì)；RcWOX10則在鹽脅迫處理后的9 h內(nèi)急劇下降，之后又恢復(fù)并呈升高趨勢(shì)，推測(cè)其可能參與了脅迫后期的修復(fù)過(guò)程[32]，表明RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9、RcWOX10基因在蓖麻抗鹽脅迫中具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究從蓖麻基因組數(shù)據(jù)中鑒定并獲得11個(gè)WOX轉(zhuǎn)錄因子，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，蓖麻RcWOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為三個(gè)分支，在古代進(jìn)化支、中間進(jìn)化支和現(xiàn)在進(jìn)化支分別有2、2和7個(gè)成員；5個(gè)RcWOXs基因除RcWOX10受干旱脅迫抑制，其余基因在干旱和鹽脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)，表明WOX類轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)蓖麻逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)起調(diào)控作用。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在逆境脅迫中的功能提供了理論參考。