福建漳浦野生稻稻瘟病抗性鑒定評價和抗性基因檢測

江 川 朱業(yè)寶 張 丹 陳立喆 王金英

(福建農業(yè)科學院水稻研究所，福建 福州 350018)

稻瘟病(Magnaporthegrisea)是由子囊菌(Magnaportheoryzae)引起的世界水稻生產中最具毀滅性病害之一。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因稻瘟病造成的水稻產量損失為10%～50%，每年經濟損失超過700億美元[1]。我國幾乎所有水稻栽培地區(qū)都有稻瘟病害的發(fā)生，稻瘟病對我國水稻造成的減產平均每年約44.6萬t[2]，尤其是南方稻區(qū)的高溫高濕氣候，有利于水稻稻瘟病的流行，多次出現(xiàn)稻瘟病大面積暴發(fā)事件，嚴重危害我國糧食生產安全[3]。實踐證明,培育和推廣抗稻瘟病品種是控制稻瘟病最經濟、有效和環(huán)保的措施[4]。但稻瘟病菌生理小種繁多且高度變異，大多數(shù)抗病品種連續(xù)種植幾年后就會因田間稻瘟病菌群體結構發(fā)生變化而喪失抗性[5-6]。因此，抗稻瘟病品種的選育必須依賴新的抗性資源的發(fā)掘和利用。

近年來我國已從水稻種質資源中篩選和鑒定出一批優(yōu)良的抗稻瘟病資源，并利用分子標記技術鑒定和定位出約100個稻瘟病抗性基因，其中有28個已被成功克隆[7-8]。Pikm、Pik、Pia、Pikh、Pita、Pib、Pita-2、Piz和Piz-t等稻瘟病抗性基因已作為特異性分子標記應用于水稻種質資源抗稻瘟病基因型的鑒定以及分子標記輔助抗病育種[9]。作為功能性標記基因，Pid2對我國稻瘟病生理小種ZB15表現(xiàn)較高的葉瘟抗性[10]，Pi9對13個國家的43個稻瘟病菌株均表現(xiàn)出較好的抗性[11]，Pi2對從我國收集的792個稻瘟病小種的絕大部分表現(xiàn)抗性[12]，Pi54(Pikh)屬于CC-NBS-LRR家族的抗病基因，抗譜較廣，Pi5對PO6-6、KJ105a等5個稻瘟病小種表現(xiàn)為抗病[13]，Pikm是由2個緊密連鎖的具有獨立功能NBS-LRR類基因Pikm1-TS與Pikm2-TS組成[14]，這些功能標記是基于與表型性狀緊密相關的功能基因的內部多態(tài)性序列而開發(fā)的標記方法，可以高效地篩選自然群體及育種群體中的有利基因[15]。目前育種上研究和利用的稻瘟病抗源大部分來自栽培稻[16]。普通野生稻是栽培稻的近緣祖先，蘊含特有的有利基因，遺傳多樣性十分豐富，并且多樣性大于栽培稻，具有抗旱性強、抗多種病害、米質優(yōu)良等特點，是水稻稻瘟病抗性育種的又一重要資源，已得到育種工作者的廣泛關注[17]。因此可以利用普通野生稻豐富有利的變異類型，不斷挖掘、定位和克隆普通野生稻的稻瘟病抗性基因，為水稻稻瘟病抗性育種提供豐富的新抗源，結合分子標記輔助技術，加速培育抗病水稻新品種。

福建漳浦野生稻是分布于我國大陸最東緯度的唯一的普通野生稻。目前已完成漳浦野生稻農藝性狀、耐冷性和部份材料的營養(yǎng)品質鑒定評價[18]。但關于福建漳浦普通野生稻稻瘟病抗性鑒定評價的研究尚未見報道。本研究在福建省上杭縣茶地鎮(zhèn)國家/省級水稻新品種抗性鑒定示范基地對福建漳浦普通野生稻資源進行苗瘟、葉瘟和穗瘟的抗性鑒定評價，并利用Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm共6個常用的抗性基因的功能標記檢測67份材料的稻瘟病抗性基因型，旨在篩選出優(yōu)異的稻瘟病抗性材料用于抗性基因挖掘和品種改良，為稻瘟病抗性基因研究和育種利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來源于種植在福建省農業(yè)科學院水稻研究所網室中的67份福建漳浦普通野生稻(表1)。

1.2 方法

1.2.1 田間自然誘發(fā)鑒定 田間自然誘發(fā)鑒定圃設在福建省上杭縣茶地鎮(zhèn)國家/省級水稻新品種抗性鑒定示范基地，該地雨量集中，空氣濕度較大，年平均氣溫20.1℃，日照時間短，是水稻稻瘟病的常發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)。供試的67份材料于2016年6月10日播種，每份材料播100粒種子，7月15日移栽，株行距為16.7 cm×16.7 cm， 7月10-13日調查苗瘟發(fā)病情況，8月25-27日調查葉瘟發(fā)病情況，10月13-23日調查穗瘟發(fā)病情況，田間管理按照常規(guī)大田進行，并在水稻整個生育期保持適當水層，增施氮肥。2017年鑒定對象為2016年鑒定結果苗瘟、葉瘟或穗瘟病級達中抗(3級)以上的15份材料，鑒定時期同2016年，并取2年中病級高的數(shù)據(jù)為最終稻瘟病抗性級別。設置感病對照品種為麗江新團黑谷，抗病對照品種為特特普。苗瘟、葉瘟和穗瘟調查參照NY/T 2646-2014[19]。

表1 67份漳浦野生稻Table 1 67 Zhangpu wild rices

1.2.2 抗性基因的分子檢測 分蘗盛期取葉片，并采用SDS抽提法[20](稍作改進)進行DNA提取。分別合成能夠擴增Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm6個基因的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，抗病基因Pikm由2個引物共同決定，其中Ckm1和Ckm2均出現(xiàn)抗病條帶為含抗性基因(表2)；PCR的擴增反應體系總體積為10 μL，包括基因組DNA 1 μL，10×Taq Buffer 1μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶0.1 μL，ddH2O補足至 10 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s(檢測Pi9、Pi5、Pi2和Pi54標記引物的退火溫度均為55℃、檢測Pid2標記引物的退火溫度為58℃、檢測Pikm標記引物退火溫度為60℃)，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min，待溫度降至16℃時取出，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR產物加3 μL 5×Loadding Buffer混勻，用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，結束后用加核酸染料染色，并在Ultra-Lum凝膠成像系統(tǒng)(美國)拍照讀帶。

表2 稻瘟病基因分子標記檢測引物信息Table 2 Marker detecting primers for rice blast gene

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2007和SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 漳浦野生稻對稻瘟病的抗性表現(xiàn)

由圖1可知，67份材料中高抗(high resistance，HR)0份；抗(resistance，R)0份；中抗(moderate resistance，MR)3份，占4.48%；中感(middle sense，MS)33份，占49.25%；感(sense，S)15份，占22.39%；高感(high sense，HS)16份，占23.88%?？沟疚敛〔牧?份，占4.48%，感病材料64份，占95.52%。感病對照品種廣二矮和麗江新團黑均表現(xiàn)高感(9級)，抗病對照品種特特普表現(xiàn)抗病(1級)。由此可見，漳浦野生稻稻瘟病抗性材料所占的比例較少，普遍不抗稻瘟病。

圖1 67份漳浦野生稻抗稻瘟病綜合評價Fig.1 Rice blast resistance grade of comprehensive assessment for 67 germplasms

2.2 不同時期的稻瘟病抗性表現(xiàn)及相關性分析

由表3可知，3個不同生育期均鑒定出抗(0～2級)和中抗(3級)野生稻材料，苗期抗(0～2級)和中抗(3級)材料分別是4份和1份；分糵期抗(0～2級)和中抗(3級)材料分別是7份和2份；成熟期抗(0～2級)和中抗(3級)材料分別是3份和5份。在苗瘟鑒定時僅有5份(7.46%)為抗病材料，62份(92.54%)為感病材料；葉瘟鑒定時有9份(13.43%)為抗病材料，58份(86.57%)為感病材料；穗瘟鑒定時有8份(11.94%)為抗病材料，59份(88.06%)為感病材料。3個時期野生稻各材料間病情差異明顯，變異系數(shù)在31.65%～43.46%之間。

通過3個時期病情指數(shù)相關分析表明，苗瘟和葉瘟呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.82，穗瘟和苗瘟、葉瘟呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.33和0.41。

表3 漳浦野生稻苗期、分糵期和成熟期期抗稻瘟病表現(xiàn)Table 3 Phenotype of rice blast resistance in seedling stage, tillering stage, and maturing stage of Zhangpu wild rice

2.3 漳浦野生稻2個自然居群稻瘟病抗性比較

漳浦野生稻群體M1來源于距離湖西畬族鄉(xiāng)趙家堡村約100 m的石湖潭。群體M2來源于在湖西畬族鄉(xiāng)嶺腳自然村的古塘。2個群體不同時期各材料稻瘟病病級差異明顯，變異系數(shù)介于28.30%～45.60%之間，3個時期中分糵期變異系數(shù)最大，石湖潭和古塘變異系數(shù)分別為41.28%和45.60%(表4)。從病級的平均值來看，苗期抗性比分糵期和成熟期抗性差。2個自然居群的苗瘟、葉瘟和穗瘟抗性差異均不顯著(表5)。

表4 2個居群稻瘟病抗性表現(xiàn)Table 4 Phenotype of rice blast resistance in 2 natural populations

2.4 6個抗性基因的分子標記檢測結果

利用Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm共6個抗性基因的分子標記基因檢測67份野生稻稻瘟病抗性基因型。由圖2可知，較多雜合基因，如Pi5位點和Pi9位點均有4份材料擴增出雜合帶型，Pi54位點有22份材料擴增出雜合帶型，Pikm2個位點分別有38份和16份材料擴增出雜合帶型，說明漳浦野生稻雜合度較高。用Pi54分子標記檢測有23份材料(M1033、M1036、M1038、M1045、M1047、M1049、M1051、M1054、M2002、M2005、M2011、M2013、M2016、M2017、M2027、M2034、M2036、M2037、M2038、M2039、M2040、M2041和M2043)出現(xiàn)216 bp抗病的特征條帶；用Pi5分子標記檢測有17份材料(M1018、M1019、M1020、M1022、M1047、M1049、M1051、M1055、M2001、M2006、M2007、M2009、M2011、M2012、M2014、M2022和M2024)出現(xiàn) 206 bp 抗病的特征條帶；用Pi9分子標記檢測有4份材料(M1002、M1018、M1033和M2009)出現(xiàn)219 bp抗病的特征條帶；用Pikm分子標記檢測有2份材料(M1018和M1027)出現(xiàn)174 bp和290 bp抗病的特征條帶；用Pi2分子標記檢測所有材料都未出現(xiàn)450 bp抗病特征條帶；用Pid2分子標記檢測所有材料都未出現(xiàn)1009 bp和629 bp抗病特征條帶。表明漳浦野生稻4份含有Pi9的抗性基因，17份含有Pi5的抗性基因，23份含有Pi54的抗性基因，2份含有Pikm的抗性基因，均不含Pi2、Pid2的抗性基因。

表5 2個居群稻瘟病病級的方差分析Table 5 Variance analysis for rice blast resistance grade in 2 natural populations

注：A: Pid2基因功能標記擴增產物；B: Pi2基因功能標記擴增產物；C: Pi5基因功能標記擴增產物；D: Pi54基因功能標記擴增產物；E: Pi9基因功能標記擴增產物；F和G:Pikm基因功能標記擴增產物；M： Marker(DM1500)；泳道1～67代表67份野生稻。Note: A: The PCR products of Pid2 functional molecular marker. B: The PCR products of Pi2 functional molecular marker.C: The PCR products of Pi5 functional molecular marker. D: The PCR products of Pi54 functional molecular marker.E: The PCR products of Pi9 functional molecular marker. F and G: The PCR products of Pikm functional molecular marker. M: DNA Marker(DM1500). Lanes 1-67 means 67 wild rice.圖2 67份野生稻稻瘟病基因的功能分子標記擴增結果Fig.2 PCR amplification of rice blast resistance genesby functional molecular markersin 67 wild rice

2.5 野生稻材料的抗性與抗性基因數(shù)量的關系

由表6可知，67份漳浦野生稻材料含有的抗性基因總數(shù)在0～3個之間，有30份材料(44.78%)不含所檢測的6個抗性基因；29份材料(43.28%)含1個抗性基因，7份材料(10.45%)含2個抗性基因，1份材料(1.49%)含3個抗性基因。經過2年稻瘟病抗性鑒定篩選出M1044、M2010和M2016共3份表現(xiàn)中抗(3級)的野生稻材料，其中M1044、和M2010不含任何檢測的抗性基因，M2016含Pi54基因。2份含有Pikm抗性基因的材料病級為9級，4份含有Pi9廣譜抗性基因的材料病級為7級或9級，17份含有Pi5抗性基因和22份含有Pi54抗性基因材料病級都在5級以上，M1018含有Pi5、Pi9和Pikm3個抗性基因病級為9級，說明Pi9、Pi5、Pi54和Pikm4個抗性基因在漳浦野生稻抗性表現(xiàn)上較弱，也未出現(xiàn)基因的累加效應，抗性未得到增強。

表6 67份野生稻材料分子標記檢測結果和抗性綜評Table 6 Marker detection and resistance grade of comprehensive assessment for 67 germplasms

表6(續(xù))

注：“+”表示含抗性基因，“-”表示不含抗性基因。

Note: ‘+’indicated the gene was contained, ‘-’ indicated the gene was not contained.

3 討論

本研究通過對67份漳浦野生稻2年的田間自然誘發(fā)鑒定試驗表明，2016年鑒定出稻瘟病中抗以上材料8份，2017年重復鑒定得到中抗以上材料9份，但鑒定的抗性材料并不完全重復。潘大建等[25]對高州野生稻、韋燕萍等[26]對廣西野生稻和梁斌等[27]對云南野生稻鑒定結果也有相似的結論，這可能與氣候條件的變化和稻瘟病生理小種的變異有關，但準確的結論還有待更深入的研究。漳浦野生稻稻瘟病抗性差，中抗(3級)材料僅占4.48%，這與何月秋等[28]對東鄉(xiāng)野生稻進行噴霧接種鑒定得出抗稻瘟病材料僅占總數(shù)的3.26%及李湘民等[29]對東鄉(xiāng)野生稻異位圃材料采用混合菌株噴霧器噴霧接種鑒定得出中抗的材料占總數(shù)的4.05%的結論基本一致。經過2年的稻瘟病抗性綜合評價得到M1044、M2010、M2016共3份稻瘟病中抗(3級)材料，可作為抗稻瘟病育種的親本材料。

漳浦野生稻3個時期的稻瘟病抗性差異明顯，苗期抗性最差，平均病級為感病(7級)，分糵期和成熟期為中感(5級)，其原因可能是苗期葉片較細嫩易感病菌。3個時期病級的相關性分析表明，苗瘟與葉瘟極顯著正相關，穗頸瘟與苗瘟、葉瘟呈極顯著正相關，說明苗期材料稻瘟病抗性強，分糵期能正常分糵生長，成熟期能正常抽穗結實，因此篩選苗瘟抗性材料對保證稻谷的質量和產量具有重要意義。此外，漳浦野生稻2個自然居群的野生稻3個不同時期的抗性差異不顯著，2個自然居群都在漳浦縣湖西畬族鄉(xiāng)境內，相距不遠，氣候和環(huán)境基本相同，表明野生稻材料在2個居群中病情趨勢具有較大程度的一致性。

范方軍等[30]、汪文娟等[31]、李剛等[32]研究表明稻瘟病抗性基因的聚合能提高材料對稻瘟病的抗性。但本研究表明攜帶Pi54、Pi5、Pi9或Pikm抗性基因的材料中，不管攜帶單個或是多個基因，僅1份攜帶Pi54基因的材料表現(xiàn)中抗，其他材料均表現(xiàn)感病。在3份表現(xiàn)中抗的材料中，2份沒有攜帶檢測的6個基因，1份攜帶Pi54基因，這3份材料可能存在其他已知或未知的新基因，但有待更深入研究。通過稻瘟病抗性基因檢測發(fā)現(xiàn)，不同位點存在較多的雜合基因型，表明漳浦野生稻雜合度較高，這與孫希平等[33]的研究結果一致。

4 結論

本研究通過對67份漳浦野生稻2年的田間自然誘發(fā)鑒定試驗表明，漳浦野生稻稻瘟病抗性較差，2年的田間自然鑒定僅獲得M1044、M2010和M2016 3份中抗材料，漳浦野生稻不含Pid2和Pi2抗性基因，含有Pi54、Pi9、Pikm和Pi5抗性基因，除M2016含有Pi54抗性基因材料表現(xiàn)為中抗，其余抗性基因在漳浦野生稻中無效。為獲得更多優(yōu)良的漳浦野生稻稻瘟病抗性資源必需擴大田間自然鑒定群體的數(shù)量并結合室內接菌鑒定，下一步研究應在基因檢測方面選擇其他的抗病基因分子標記繼續(xù)鑒定M1044、M2010和M2016 3份中抗材料的基因型，找到對漳浦野生稻有影響的抗性基因。本研究結果為野生稻的基礎研究和利用提供了一定理論參考。