結(jié)直腸癌患者血漿circPRMT5表達(dá)水平及臨床意義

王洪偉 王琳琳 張翼飛 于永生 劉玉偉 李重 劉欣然

結(jié)直腸癌是高發(fā)病率和高死亡率的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷成為改善結(jié)直腸癌治療效果的重要手段。血漿中非編碼RNA分子的檢測，能夠有助于腫瘤的早期診斷［2］。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，是具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的小RNA分子［3］。circRNA分子形成的機(jī)制主要包括“外顯子跳躍”和前體mRNA的“反向剪切”兩種方式［4-5］。盡管很早就有研究發(fā)現(xiàn)了真核細(xì)胞中存在circRNA分子，但是早期的理論認(rèn)為circRNA分子是無功能的“垃圾”分子。近些年來，隨著深度測序技術(shù)的不斷應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)了大量的外顯子或內(nèi)含子circRNA，這說明了circRNA并不是錯誤剪切的產(chǎn)物，而是具有多種調(diào)控功能的RNA分子［2］。circRNA因為其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使得其不易降解，是具有前景的分子標(biāo)志物。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)了血漿中的circRNA分子與患者的生存密切相關(guān)［6］。這提示我們血漿circRNA可以作為潛在的分子標(biāo)志物。

本文通過高通量芯片技術(shù)對結(jié)直腸癌患者血漿circRNA分子進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)circPRMT5在結(jié)直腸癌患者血漿中高表達(dá)。同時，我們發(fā)現(xiàn)血漿circPRMT5與結(jié)直腸癌患者的生存密切相關(guān)，也是預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。因此，本研究發(fā)現(xiàn)血漿circPRMT5是結(jié)直腸癌腫瘤中新的分子標(biāo)志物。

資料與方法

一、血漿樣本與臨床信息

276例非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者與37例正常人群血漿樣本來源于2012年1月至2013年1月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科，正常人群均經(jīng)過腸鏡證實無腸道腫瘤。所有患者經(jīng)腸鏡檢查，病理明確為腺癌，肝臟MRI和肺臟CT排除患者遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。所有患者臨床信息完整，定期隨訪?？偵鏁r間定義為患者確診結(jié)直腸癌日期至患者死亡日期，無復(fù)發(fā)生存時間定義為患者確診結(jié)直腸癌日期至第一次診斷復(fù)發(fā)日期。在確診之后，手術(shù)之前，獲得10 mL患者血液樣本，3 000 rpm離心后，分離獲得血漿成分，分裝后，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存。腫瘤TNM分期根據(jù)第六版UICC腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有實驗過程符合赫爾辛基宣言，并且在實驗開始前所有患者均簽署知情同意書。

二、血漿RNA的提取

使用Qiagen公司miRNeasy Serum Plasma Advanced Kit試劑盒。取200 μL血漿，加入60 μL RPL緩沖液，渦旋至少5秒后，室溫下靜置3 min。加入20 μL RPP緩沖液，渦旋至少20 s后，室溫下靜置3 min。室溫下12 000 g離心3 min，棄掉沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1倍體積的異丙醇，渦旋充分混勻；將全部混合液轉(zhuǎn)移到RNeasy UCP MinElute柱中，8 000 g離心15 s，棄掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱加入700 μL RWT緩沖液，8 000 g離心15 s，棄掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱中加入500 μL RPE緩沖液，8 000 g離心15 s，棄掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱 中 加 入 500 μL 80% 的 乙 醇，8 000 g離心2 min，棄掉穿流液；將RNeasy UCP MinElute柱置于2 mL新的收集管中，8 000 g離心5 min，棄掉穿流液和收集管；將RNeasy UCP MinElute柱置于1.5 mL的收集管中，加入20 μL無RNA酶水，室溫孵育1 min，8 000 g離心1 min，洗脫RNA。

三、RNA的提取和芯片雜交

根據(jù)ArrayStar公司標(biāo)準(zhǔn)。提取RNA后，經(jīng)過RnaseR消化去除線性RNA，使用Arraystar Super RNA Labeling Kit試劑盒擴(kuò)增并熒光標(biāo)記circRNA分子。而后，將標(biāo)記的circRNA分子與ArrayStar人類circRNA分子芯片雜交，之后使用Agilent Scanner G2505C掃描芯片。芯片圖像使用Agilent Feature Extraction軟件分析，表達(dá)倍數(shù)大于2并且P值小于0.05認(rèn)為是具有差異表達(dá)的circRNA。所有患者每1個月規(guī)律電話隨訪，詢問患者生存狀態(tài)與復(fù)發(fā)狀態(tài)。無復(fù)發(fā)生存時間定義為手術(shù)日期至第一次臨床確診復(fù)發(fā)日期之間的時間間隔，刪失數(shù)據(jù)定義為手術(shù)日期至幸存者最后一次隨訪日期之間的時間間隔。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 23.0。circPRMT5與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，采用卡方檢驗；計數(shù)參數(shù)之間的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗或者非參數(shù)檢驗?？偵鏁r間和無復(fù)發(fā)生存時間之間的比較，采用Kaplan-Meier和對數(shù)秩檢驗法，預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立因素分析，采用COX回歸分析；P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌患者血漿circRNA表達(dá)譜

為了研究結(jié)直腸癌患者血漿circRNA的差異表達(dá)，我們采用了circRNA芯片技術(shù)，分析比較了5例結(jié)直腸癌患者血漿與5例正常人群血漿circRNA的表達(dá)情況。差異circRNA的表達(dá)如火山圖所示（圖1），我們共篩選獲得到31個高表達(dá)的circRNA分子和38個低表達(dá)的circRNA分子。在高表達(dá)circRNA中，有26個外顯子circRNA，3個內(nèi)含子circRNA和2個反義circRNA分子；在低表達(dá)circRNA中，有25個外顯子circRNA，6個內(nèi)含子circRNA，5個基因間circRNA和2個反義circRNA分子。我們選取了在結(jié)腸癌患者血漿中表達(dá)最高的circPRMT5作為后續(xù)研究的目標(biāo)分子。而后收集了276例結(jié)直腸癌患者的血漿和37例正常人群的血漿，通過PCR技術(shù)檢測證實，circPRMT5在結(jié)直腸癌患者血漿中高表達(dá)，為10.33±3.41；正常人群為8.77±3.74（t=2.58，P=0.01）。

圖1 circRNA表達(dá)火山圖

二、研究人群的一般特征

我們收集了本科室276例結(jié)直腸癌患者的血漿樣本，通過PCR的方法檢測了circPRMT5的表達(dá)，根據(jù)表達(dá)量的中位值，將人群分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。比較了年齡、性別、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)清掃數(shù)目、血管瘤栓、淋巴管瘤栓和神經(jīng)侵犯等病理指標(biāo)。通過比較發(fā)現(xiàn)circPRMT5高表達(dá)組患者的年齡更高，男性患者比例較多。circPRMT5高表達(dá)組患者腫瘤分期更晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，并且不良預(yù)后相關(guān)的病理因素更多（表1）。

三、circPRMT5是預(yù)測結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素

為了進(jìn)一步研究circPRMT5在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義，我們對276例患者進(jìn)行了隨訪，中位隨訪時間為38個月，通過Kaplan-Meier生存曲線，比較了circPRMT5高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的生存差異，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)circPRMT5的患者生存時間明顯短于低表達(dá)circPMRT5組患者（圖2，Log rank P=0.006）。同時高表達(dá)circPRMT5的患者的無復(fù)發(fā)生存時間明顯短于低表達(dá)circPRMT5（圖3，Log rank P=0.025）。進(jìn)一步尋找影響患者生存的因素，我們采用了單因素和多因素COX回歸分析，通過分析我們發(fā)現(xiàn)circPRMT5的表達(dá)水平是判斷患者總生存時間與無復(fù)發(fā)生存時間的獨(dú)立危險因素（表2）。

表1 患者一般病理特征（例）

圖2 患者總生存時間的比較

圖3 患者無復(fù)發(fā)生存時間的比較

表2 circPRMT5表達(dá)水平是患者總生存時間與無復(fù)發(fā)生存相關(guān)的獨(dú)立危險因素

討 論

在本研究中，通過circRNA芯片篩選我們發(fā)現(xiàn)了circPRMT5在結(jié)直腸癌患者血漿中顯著高表達(dá)。在更大量人群樣本中，通過進(jìn)一步驗證，我們證實了circPRMT5在結(jié)直腸癌患者血清中高表達(dá)，提示circPRMT5可能是結(jié)直腸腫瘤患者的臨床標(biāo)志物。結(jié)合人群的臨床病理學(xué)特征，高表達(dá)circPRMT5提示了更差的臨床預(yù)后，并且與預(yù)后不良的病理學(xué)指標(biāo)相關(guān)。通過多因素COX回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)circPRMT5是提示患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。

目前越來越多的研究顯示circRNA是重要的非編碼RNA分子，發(fā)揮了多種多樣的生物學(xué)調(diào)控作用。不僅如此，circRNA特有的更加穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，使其成為更加有潛力的臨床標(biāo)志物。目前已經(jīng)有多項研究發(fā)現(xiàn)，血漿circRNA分子能夠作為診斷疾病的分子標(biāo)志物［7-9］。血漿circRNA0004904/0001855能夠作為診斷孕婦子癇的、新的血漿分子標(biāo)志物［10］；血漿中的circRNA還能作為判斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的分子標(biāo)志物［11］。在腫瘤患者血漿中可以檢測到circRNA分子的表達(dá)，這些研究還發(fā)現(xiàn)了circRNA分子是具有很強(qiáng)的臨床診斷意義［12-13］。crcRNA0000285的表達(dá)水平與鼻咽癌患者的預(yù)后明顯相關(guān)，同時也和鼻咽癌患者對放療的敏感性密切相關(guān)［14］。circ0004018在肝癌組織中高表達(dá)，是肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后相關(guān)的重要分子標(biāo)志物［15］。circPRMT5在前列腺癌患者血漿中高表達(dá)，能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移［16］。我們的研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者血漿中，circPRMT5顯著高表達(dá)。更為重要的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)了circPRMT5是重要的臨床分子標(biāo)志物。通過我們的分析發(fā)現(xiàn)了，circPRMT5的高表達(dá)組患者中，腫瘤分期更晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目更多，提示預(yù)后不良的病理因素也更多。通過生存分析，我們還發(fā)現(xiàn)與低表達(dá)組患者相比，高表達(dá)circPRMT5的患者的總生存時間和無復(fù)發(fā)生存時間更短；經(jīng)過單因素和多因素的COX回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)了circPRMT5的表達(dá)水平，是預(yù)測患者總生存和無復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立危險因素。由此，我們發(fā)現(xiàn)了circPRMT5是結(jié)直腸癌中重要的分子標(biāo)志物。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)circPRMT5在結(jié)直腸癌患者血漿中高表達(dá)，同時也是重要的臨床分子標(biāo)志物。circPRMT5與患者的腫瘤分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目等相關(guān)病理學(xué)指標(biāo)密切相關(guān)。高表達(dá)circPRMT5也不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者中新的血漿分子標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌患者早期診斷和預(yù)后判斷方面帶來新的思路。