miRNA-1236通過靶向FOXO3a調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究

孫宇 朱琳 劉禎璐 楊明 余貞 孫靜 王妍 蔣雨含 李紅巖 孫輝,4

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在中國癌癥發(fā)病率中排名第二，世界癌癥發(fā)病率排名第三，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。在亞洲，尤其是在發(fā)展中國家，CRC的發(fā)病率在1998年至2007年間迅速上升，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康［2］。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞家族3a（FOXO3a）是FOXO家族的抑癌基因，可以調(diào)控多種參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的基因，如BIM（細(xì)胞死亡的Bcl-2相互作用介質(zhì)），PUMA（p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子），CKI（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑），p27Kip1，cyclin D1（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶D1）。它控制著腫瘤細(xì)胞的各種信號通路和多種生物學(xué)過程［3］。FOXO3a表達(dá)降低與乳腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和耐藥有關(guān)［4-7］。同時有研究報道在CRC中FOXO3a表達(dá)異常降低，提示其可能具有抑癌作用［8-9］。

MicroRNAs（miRNAs）是一種非編碼小RNA分子，通過部分序列同源性結(jié)合到哺乳動物mRNA的30個未翻譯區(qū)域（3′UTR），并引起蛋白質(zhì)翻譯抑制或mRNA降解，或兩者都發(fā)生，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)［10］。同時有研究表明miR-1236，可通過ceRNA作用方式參與LncRNA FAL1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖［11］。其在結(jié)直腸癌中有無作用尚無明確報道，本實(shí)驗(yàn)旨在證明FOXO3a為miR-1236的靶基因，為進(jìn)一步闡明miR-1236在腫瘤信號通路中發(fā)揮的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

收集2018年1月至2018年6月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院10例經(jīng)病理學(xué)確診為結(jié)直腸腺癌患者的癌組織和癌旁組織，所有實(shí)驗(yàn)都遵照哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行收集。

二、實(shí)驗(yàn)方法

本研究通過http://ualcan.path.uab.edu/網(wǎng)站獲取了TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO3a在結(jié)直腸癌患者中各種樣本的表達(dá)。本研究檢測了FOXO3a基因在癌-癌旁，不同腫瘤階段與不同性別中的表達(dá)。

（一）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞在5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，加入10%的胎牛血清，100 ug/mL的抗生素（青霉素，鏈霉素）。依據(jù)不同處理方法，分為5組：（1）對照組（空白對照）；（2）陰性對照組1（轉(zhuǎn)染不含miR-1236 mimics的脂質(zhì)體）；（3）miR-1236 mimics組（轉(zhuǎn)染含miR-1236 mimics的脂質(zhì)體）；（4）陰性對照組2（轉(zhuǎn)染不含miR-1236 inhibitor的脂質(zhì)體）；（5）miR-1236 inhibitor組（轉(zhuǎn)染含miR-1236 inhibitor的脂質(zhì)體），通過Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞中，經(jīng)過48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

（二）免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

取結(jié)直腸癌組織做成組織切片，一抗于4 ℃用微量離心機(jī)以1 500轉(zhuǎn)離心2 min，室溫孵育1 h，完成后用PBS清洗3次，每次5 min。二抗于4 ℃用微量離心機(jī)以1 500 轉(zhuǎn)離心2 min，室溫孵育1 h，完成后PBS清洗3次，每次5 min。將蓋玻片放于紙巾上，滴加1滴Gelvatol于蓋玻片中央。翻轉(zhuǎn)載玻片放于蓋玻片上，勿施壓。將玻片置工作臺上，用鋁箔覆蓋避光放置30 min，使Gelvatol凝結(jié)。顯微鏡觀察結(jié)果。

（三）蛋白免疫印跡法

將含蛋白酶抑制劑（羅氏，瑞士）和RIPA裂解液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，裂解細(xì)胞，超聲破碎3次后，13 500轉(zhuǎn)/min（4 ℃）離心12 min并收集上清液。利用BCA法進(jìn)行蛋白定量。通過12.5% SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上（Pall公司，美國）。室溫封閉后1 h后，分別與一抗β-actin（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA），PCNA（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA），Bax（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA）和 FOXO3a（1:500，萬類生物，中國）于4 ℃冰箱中孵育過夜。PBST洗滌3次，每次15 min后，分別用抗兔或抗鼠二抗（1:10 000）室溫孵育1 h。通過理光公司的紅綠熒光顯色進(jìn)行發(fā)光。

（四）CCK-8細(xì)胞活性檢測

本研究選用CCK-8細(xì)胞活性試劑盒（碧云天，上海，中國）來檢測轉(zhuǎn)染miR-1236后HCT116細(xì)胞的活性。首先，將約5×104個細(xì)胞接種于96孔板中。當(dāng)達(dá)到所需匯合程度后，將細(xì)胞放在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中分別轉(zhuǎn)染miR-1236 mimic和miR-1236 inhibitor及其相應(yīng)的陰性對照48 h后，按照CCK-8操作流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并在酶標(biāo)儀中測量490 nm處的吸光度，使用以下公式計算細(xì)胞活力百分比：

細(xì)胞活力的百分比=（實(shí)驗(yàn)樣本的吸光度/對照的吸光度）×100%。

（五）克隆形成

將8×102個HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中14天后。棄去培養(yǎng)基，并用PBS漂洗。用20%甲醇固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，棄去上膜表面細(xì)胞。統(tǒng)計超過100個細(xì)胞組成的菌落為計數(shù)單位。在顯微鏡下隨機(jī)選取五個區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行拍照和計數(shù)。

（六）Ki-67 免疫熒光

HCT116細(xì)胞接種于含有無菌蓋玻片的6孔板中，分別轉(zhuǎn)染miR-1236 inhibitor以及其miR-inhibitor NC 48 h后。將Ki-67（Cell Signaling Technology，美國）抗體孵育1 h后，加入熒光顯色劑Alexa-488在室溫孵育20 min。然后，用DIPA染細(xì)胞核。通過免疫熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝。

（七）RNA提取和實(shí)時定量PCR

采用Trizol試劑提取總RNA（Invitrogen公司，美國）。利用superscriptase II（Invitrogen公司，美國）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時定量PCR法檢測miR-1236表達(dá)水平。實(shí)時定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Life Technologies， 美 國），PCR儀 為ABI 7500實(shí)時定量PCR儀（ABI，美國），PCR擴(kuò)增條件為：95 °C 變性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C延伸35 s，共30個循環(huán)。以下引物用于實(shí)時熒光 定 量 PCR 檢 測：miR-1236-F：5′-UCUGGCU CCGUGUCUUCAC UCCC-3′；miR-1236-R：5′-UUCUCCGAACGUG UCACGU-3′；GAPDH-F：5′-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3′；GAPDH-R：5′-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3′。

（八）Luciferase基因分析報告

將5×103個HCT116細(xì)胞接種于96孔板，24 h后，通過lipofectamine 2 000共轉(zhuǎn)染pmirglo-FOXO3-wt或 pmirglo-FOXO3-mut＋ miR-1236或miR-mimic NC。48 h后收集相應(yīng)的細(xì)胞，按照luciferase報告實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行檢測熒光素酶活性。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 5.0軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3～6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SD）表示。所有數(shù)據(jù)采用配對t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-1236對于結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116活性的影響

為了研究miR-1236在結(jié)直腸癌中的作用，本研究首先通過qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染miR-1236 mimic以及inhibitor后miR-1236的表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)miR-1236 inhibitor組相對于陰性對照明顯降低，而miR-1236 mimic組相對于陰性對照，其表達(dá)明顯升高（圖1A）。隨后，本研究通過CCK-8方法檢測miR-1236對于HCT116細(xì)胞活性的變化，低表達(dá)miR-1236后能夠明顯降低HCT116的活性，而高表達(dá)miR-1236能夠促進(jìn)HCT116細(xì)胞的活性增加（圖1B）。同時通過克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-1236對于HCT116細(xì)胞活性的變化，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與CCK-8結(jié)果相同（圖1C）。隨后，通過Ki67實(shí)驗(yàn)檢測低表達(dá)miR-1236后，HCT116細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果顯示，miR-1236 inhibitor組細(xì)胞增殖能力相對于NC對照組明顯降低（圖1D）。同時，本研究檢測了增殖相關(guān)蛋白PCNA以及BAX蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1236 inhibitor后相對于NC對照組，miR-1236 inhibitor 組中PCNA以及BAX蛋白明顯下調(diào)（圖1E～1F）。以上的結(jié)果說明，miR-1236能夠調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞的活性，同時能夠影響HCT116細(xì)胞的增殖。

圖1 miR-1236對于結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116活性的影響。1A：逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-1236mimic或者miR-1236inhibitor后miR-1236的表達(dá)；1B：CCK-8檢測轉(zhuǎn)染miR-1236后HCT116細(xì)胞的活性變化；1C：克隆形成檢測轉(zhuǎn)染miR-1236后HCT116細(xì)胞的活性變化；1D：ki-67檢測低表達(dá)miR-1236對于HCT116細(xì)胞增殖能力的影響；1E～1F：Western blot 檢測低表達(dá)miR-1236對于HCT116細(xì)胞中PCNA 以及Bax蛋白的變化，與對照組相比*P＜0.05

二、miR-1236通過靶向調(diào)節(jié)FOXO3參與HCT116細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步研究miR-1236對于結(jié)直腸癌增殖能力的影響，本研究首先通過生物信息學(xué)網(wǎng)站（www.targetscan.org）尋找miR-1236的潛在作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-1236與FOXO3有潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。同時，luciferase報告結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1236-mimic可明顯抑制FOXO3a-wt組的熒光素酶活性，而對FOXO3-Mut組沒有作用（圖2B）。隨后，通過免疫蛋白印記方法以及實(shí)時定量PCR方法檢測分別轉(zhuǎn)染miR-1236-mimic或inhibitor后，F(xiàn)OXO3a蛋白以及mRNA的變化，結(jié)果顯示，miR-1236-mimic組相對其NC組能夠明顯降低FOXO3a蛋白以及mRNA的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-1236-inhibitor后，F(xiàn)OXO3蛋白以及mRNA水平顯著上調(diào)（圖2C～2D）。以上的結(jié)果說明，miR-1236與FOXO3a存在靶向調(diào)節(jié)作用。

三、FOXO3對于結(jié)直腸癌的作用

既然，F(xiàn)OXO3a是miR-1236的靶基因，進(jìn)而影響HCT116增殖能力的變化，那么，F(xiàn)OXO3a在結(jié)直腸癌的作用到底是什么呢?本研究通過TCGA網(wǎng)站檢測了FOXO3a在結(jié)直腸癌中的作用，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a在結(jié)直腸癌組織中相對于正常組織明顯降低（圖3A）。隨后，本研究對于不同階段的結(jié)直腸患者組織進(jìn)行分析，本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌的第一階段，F(xiàn)OXO3a表達(dá)相對于健康人明顯降低（圖3B），同時，本研究還對不同性別的患者進(jìn)行了檢測，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a在男性患者中降低的更為明顯（圖3C）。為了進(jìn)一步確認(rèn)，F(xiàn)OXO3a在結(jié)直腸癌中的作用，本研究采用免疫組化方法檢測結(jié)直腸癌患者中癌-癌旁中的表達(dá)，結(jié)果顯示在結(jié)直腸患者中FOXO3a表達(dá)相對于癌旁組織表達(dá)明顯降低。

圖2 mir-1236通過靶向FOXO3a基因調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞增殖。2A：TargetScan軟件預(yù)測，F(xiàn)OXO3a基因與mir-1236潛在種子序列；2B：熒光素酶報告分析；2C、2D：分別轉(zhuǎn)染mir-1236-mimic或mir-1236 inhibitor后FOXO3a的蛋白和mRNA表達(dá)。*與對照組相比P＜0.05

討 論

在臨床上，40～50歲年齡組的CRC發(fā)生率較高。男性發(fā)病率是女性的2～3倍。隨著我國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，CRC的發(fā)病率呈逐年上升的年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生活質(zhì)量［12］。CRC早期癥狀不明顯，容易漏診?；颊叨酁橥砥?，治療難度大，療效差，預(yù)后差。因此如何診斷預(yù)防以及治療結(jié)直腸癌成為廣大醫(yī)學(xué)工作者需要解決的問題。

FOXO是一類進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與許多生物過程的調(diào)控，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡。FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族共有4個成員，分別是FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，其中FOXO3是研究最多的核心成員［6-7］。在本研究的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)CRC時FOXO3a表達(dá)異常降低，提示其可能具有抑癌作用［8-9］。

同時miR-1236參與多種癌癥的生理過程，可通過抑制HDAC3和SENP1表達(dá)來調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［13］，還可以靶向激活p21WAF1/CIP1，抑制腎細(xì)胞癌增殖［14］。然而本研究的結(jié)果顯示miR-1236能夠?qū)τ诮Y(jié)直腸癌細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-1236后能夠促進(jìn)HCT116細(xì)胞活性增加，而低表達(dá)miR-1236后不僅僅能影響細(xì)胞活性，還能使其增殖能力相對于NC對照組明顯減弱（圖1D～1F），提示本研究miR-1236參與了結(jié)直腸癌的病理生理過程（圖1）。本研究的結(jié)果與Li等［11］人的研究相似，他們報道了，miR-1236能夠通過ceRNA方式抑制肝細(xì)胞癌的增殖。而后，為了進(jìn)一步確定miR-1236是如何發(fā)揮其作用的，本研究通過生物信息學(xué)網(wǎng)站查詢了相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)FOXO3a與miR-1236有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。通過luciferase實(shí)驗(yàn)，確定了FOXO3a為miR-1236的靶基因（圖2），同時，檢測了過表達(dá)miR-1236后FOXO3a蛋白以及mRNA水平的變化，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR1236能夠明顯抑制FOXO3a的表達(dá)，而低表達(dá)miR-1236能夠增加FOXO3a的表達(dá)。以上的結(jié)果提示：結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中，miR-1236通過抑制FOXO3a的表達(dá)從而發(fā)揮促癌作用，同時，通過TCGA以及免疫組化的方法證明了，F(xiàn)OXO3a在結(jié)直腸癌中低表達(dá)（圖3），而本研究的結(jié)果也符合miRNA靶向靶基因的經(jīng)典作用機(jī)制。

總之，本研究結(jié)果首次證明了miR-1236對于結(jié)直腸癌增殖能力的作用，而miR-1236的作用是直接調(diào)控FOXO3a基因進(jìn)而實(shí)現(xiàn)的，同時FOXO3a在結(jié)直腸癌中是一個抑癌因子。本研究的結(jié)果為miR-1236可能成為結(jié)直腸癌患者的一種潛在治療藥物或者靶點(diǎn)提供了有力證據(jù)。

圖3 FOXO3a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。3A：TCGA數(shù)據(jù)庫檢測FOXO3a在癌癥-癌旁中的表達(dá)；3B：TCGA數(shù)據(jù)庫檢測FOXO3a在不同腫瘤階段中的表達(dá)；3C：TCGA數(shù)據(jù)庫檢測FOXO3a與不同性別的表達(dá)；3D：免疫組化檢測FOXO3a在男性患者中結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)